تغییر در صفات رویشی و شاخص‌های فیزیولوژیک گیاهان لوبیا تحت تنش روی در محیط‌کشت هیدروپونیک

رشد و نمو گیاهان زراعی به عواملی نظیر نور، حرارت، اکسیژن، آب و غیره و همچنین مواد آلی و معدنی در حد مطلوب و در زمان مناسب بستگی دارد. کمبود و یا افزایش بیش از حد مطلوب هر یک از عوامل موثر بر رشد، اختلالات فیزیولوژیکی را در گیاهان زراعی به همراه دارد. تنش در موجودات زنده به معنی انحراف از شرایط مطلوب برای زندگی تعریف می­شود. هرعامل محیطی که باعث ایجاد صدمه یا خسارت در موجود زنده شود، تنش نام دارد

]16[.

فلزات سنگین از جمله آلاینده‏های زیست محیطی هستند که مواجه شدن انسان با بعضی از آن­ها از طریق آب ومواد غذایی می­تواند مسمویت­های مزمن و بعضاً حاد خطرناکی را ایجاد نماید که از جمله آنها می­توان به فلزاتی نظیر سرب، جیوه، نیکل، کادمیوم، آلومینیم، آرسنیک، روی، مس و آهن اشاره کرد]29[.

فلزات سنگین دو گروه هستند، برخی همچون مس و روی برای رشد و نمو گیاه ضروری بوده و به­عنوان جزء اصلی در ساختار بسیاری از آنزیم­ها و پروتئین­ها نقش دارند ]21 ،33[، و برخی برای متابولیسم گیاه و جانور غیر­ضروری هستند مثل سرب و کادمیوم که اغلب در غلظت­های پائین سمی هستند ]10[، اگر چه همه­ی فلزات سنگین در غلظت­های بالا اثرات سمی دارند و آلودگی محیطی را ایجاد می­کنند.

امروزه به دلیل توزیع مواد زاید خانگی، پساب­های صنعتی، فعالیت­های کشاورزی، اکتشاف و استخراج معادن توسط انسان، محیط­زیست در معرض
آلاینده­های معدنی و آلی می­باشد. اصلی­ترین ترکیب آلودگی­های معدنی فلزات سنگین از جمله مس، روی، آهن و کادمیوم می­باشد ]32[.

روی(Zinc) به­عنوانیکعنصرضروریبرایرشد­و­نموگیاهاننقشساختاریوعملکردیفراوانیدربسیاریازفرآیندهای متابولیکیگیاهانبر­عهدهدارد، ولیمقداراضافیآنبه­خصوصدرخاک­هایاسیدییکفاکتورمحدود­کنندهرشدبرایگیاه محسوب می­شود ]16[.

شریعت و عصاره در سال 1385 نشان دادند که مقادیر پایین عنصر سنگین روی (1 میلی مولار) تاثیر چندانی بر جوانه­زنی و رشد ریشه­چه و ساقه­چه اکالیپتوس نداشته است]27[.Palacios نشان داد که نیکل در گیاه گوجه فرنگی و همچنین مس درBrassica PekinesisRupr]34[ اثرات بازدارندگی بر شاخص­های رشد دارند.

Garty و همکاران ]13[ در سال 1992 نشان دادند که روی در غلظت زیاد خود سبب کاهش کلروفیل در گلسنگ­ها می­شود.

این پژوهش با هدف بررسی اثر روی بر برخی از شاخص­های رویشی و فیزیولوژیک گیاه لوبیا و نیز حد تحمل آن به غلظت­های مختلف روی در محیط هیدروپونیکطراحی و اجرا شد.

مواد و روش‌ها

بررسی جوانه­زنی بذرها

بذرهای مورد استفاده در این تحقیق متعلق به گونه‌ی Phaseolus vulgaris (Sayad cultivar) از خانواده Fabaceae می‌باشد. پژوهش حاضر بر روی یک نوع از این جنس به نام‌ رقمصیاد صورت گرفت. بذر مذکور از مرکز تحقیقات و اصلاح نباتات استان البرز تهیه گردید.

بذرهای ضدعفونی شده در پتری­های شاهد (فقط آب مقطر به مقدار ml5 به آن‌ها اضافه گردید) و پتری­های حاوی غلظت­های 30، 40 و 50 میکرو مولار نیترات روی (₂Zn(No3))تحت دمای 25 درجه‌ی سانتی‌گراد (در داخل انکوباتور) به مدت یک هفته کشت داده شدند. تعداد بذرهای جوانه زده در هر پتری به فواصل یک روزه شمارش و ثبت گردید.سرعت جوانه‌زنی بذرها از رابطه زیر محاسبه گردید ]18[.:

Vg= سرعت جوانه­زنی برحسب تعداد بذر در روز، Ni= تعداد بذر جوانه زده در هر روز، Di= شماره روز

کشت گیاه لوبیا

بذرهای لوبیا ابتدا در ظروف نشا کشت شده سپس گیاهان یکنواخت از نظر اندازه انتخاب و به ظروف تیره‌ی (350 میلی‌لیتر) حاوی محلول هوگلند نیم قدرت (محیط هیدروپونیک) انتقال یافتند. پس از مدت زمان 24 ساعت، تحت تیمارهای مختلف نیترات روی با غلظت‌های 30، 40و 50 میکرو‌مولار قرار گرفتند. گیاهان برای مدت 20 روز در اتاقی با شدت روشنایی4000 لوکس و در دما و رطوبت آزمایشگاه رشد کردند. طول دوره روشنایی و تاریکی به ترتیب 16 و 8 ساعت بود و pH در تمام محلول­های غذایی تهیه شده در حد 5/6 تنظیم گردید (شکل 1).

سنجش فاکتورهای رشد

پس از 20 روز گیاهان از محیط کشت خارج شدند و به سرعت وزن تر اندام­های هوایی بر حسب گرم، طول ریشه و ساقه بر حسب میلی­متر، سطح پهنک برگ­ها بر حسب سانتی­متر مربع اندازه­گیری شد. عمل خشک کردن نمونه­های گیاهی در آون 70 درجه سانتی­گراد به مدت 48 ساعت صورت گرفت. وزن خشک نمونه­ها بر حسب گرم بدست آمد.

جهت سنجش کمی رشد در گیاهان کشت شده تحت تیمار و مقایسه آن­ها با یکدیگر، شاخص­های رشد شامل نسبت سطح برگ (LAR)، سطح ویژه برگی (SLA)، وزن مخصوص برگ (SLW)، نسبت وزن برگی (LWR) و محتوای آب در واحد سطح برگ (LWCA)اندازه­گیری شد.

Leaf Area Ratio))LAR: نشان­دهنده سطح فتوسنتز کننده به وزن خشک کل گیاه است، برحسب g/²cm وزن خشک گیاه بیان می­شود .

همچنین طبق این فرمول هم بدست می­آید:

در این رابطه LAکل سطح بافت­های فتوسنتزکننده وTDW وزن خشک کل گیاه است.

میانگین LAR عبارت است از:

(Specific Leaf Area)SLA:میزان سطح برگ یک گیاه را بر اساس وزن خشک برگ­ها نشان
می­دهد. برحسب ^1-g .cm² ماده­ی خشک معرفی
می­شود.

LA= سطح برگ

LDW = ماده­ی خشک برگ­ها

SLW (Specific Leaf weight): وزن مخصوص برگ بر حسبgr/cm² محاسبه می‌شود .

LWR(Leaf Weight Rate): نسبت وزن برگی برحسب gg^-1وزن خشک معرفی می­شود.

(Leaf Water Contentper unitleafArea)LWCA: محتوای آب در واحد سطح برگ برحسب گرم بر متر مربع محاسبه می­گردد. در این رابطه LFW وزن تر برگ، LDW وزن خشک برگ و L سطح برگ است .

سنجش رنگیزه­های فتوسنتزی

برای اندازه­گیری میران کلروفیل، 0.1 گرم از برگ گیاه وزن شد و در هاون چینی با 10 میلی­لیتر استون 80%به آرامی بافت برگ له و به صورت مخلوطی یکنواخت و همگن درآمد سپس با استون 80% به حجم 20 میلی­لیتر رسانده شد. نمونه­ها در سانتریفوژ (Sigma, K1501, Germany) با دور 4800 (دور در دقیقه) به مدت 20 دقیقه قرار گرفتند. در نهایت با دستگاه اسپکتروفتومتر (Biowave II, England) میزان جذب برای کلروفیل قرائت گردیدو با استفاده از فرمول­های زیر محتوای کلروفیل کل بر حسب
میلی­گرم وزن تر محاسبه شد ]6[.

₆₄₅A×00269/0- ₆₆₃A×0127/0= غلظت کلروفیلa

₆₆₃A×0046/0- ₆₄₅A×0229/0= غلظت کلروفیل b

₆₆₃A×00802/0+₆₄₅A×0202/0=غلظتکلروفیل(a+b)

₆₄₅A = میزان جذب در طول موج 645

₆₆₃A= میزان جذب در طول موج 663

سنجش کربوهیدرات­ها به روش فنل- اسیدسولفوریک

برای اندازه‌گیری قندهای محلول و نامحلول از روش فنل- اسید سولفوریک استفاده شد. این روش بر اساس هیدرولیز اسیدی قندهای محلول و ایجاد ترکیب فورفورال قرار دارد که با فنل تولید یک ترکیب کمپلکس رنگی می­کند]17[.

اندازه‌گیری قندهای محلول

نمونه­ها در داخل آون به مدت 24 ساعت در دمای 50 درجه سانتی­گراد خشک شدند. 10 میلی­لیتر اتانول 70% به 0.1 گرم از نمونه­های خشک شده اضافهو به مدت یک هفته در یخچال نگهداری گردید. 0.5
میلی­لیتر از محلول رویی نمونه­ها برداشته با آب مقطر به حجم 2 میلی­لیتر رسانده شد و روی آن 1 میلی­لیتر فنل 5 درصد اضافه کرده، خوب به هم زده و بر روی آن 5 میلی­لیتر اسید سولفوریک غلیظ با فشار اضافه گردید، محلول زرد رنگی بدست می­آید که به مرور تغییر رنگ می­دهد و به قهوه­ای روشن تمایل پیدا
می­کند، این محلول را نیم ساعت در دمای آزمایشگاه قرار داده و میزان جذب با استفاده از اسپکتروفتومتر در طول موج 485 نانومتر اندازه­گیری شد.

اندازه‌گیری قندهای نامحلول

رسوب باقیمانده از مرحله­ی قبل بر برای اندازه‌گیری قندهای نامحلول موجود در برگ استفاده شد. ابتدا رسوب را خشک و سپس آن را وزن نموده و در لوله­ی آزمایش ریخته و بر روی آن 10 میلی­لیتر آب مقطر اضافه نموده و به مدت 15 دقیقه در بن ماری آب جوش قرار داده شد. سپس آن را صاف نموده و حجم محلول عبور کرده از صافی را با آب مقطر به 25 میلی­لیتر رسانده و در نهایت 2 میلی­لیتر از این محلول برداشته وقندهای نامحلول آن به روش فنل- اسید سولفوریک در طول موج 485 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه­گیری گردید.

مقادیر قند نمونه­ها با استفاده از منحنی استاندارد بر اساس میلی­گرم بر وزن خشک محاسبه گردید.

در پایان، داده­های به­دست آمده از این پژوهش با استفاده از نرم­افزار SAS(version9.1)توسط آزمون دانکن بر پایه طرح کاملاً تصادفی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

نتایج و بحث

نتایج آنالیزهای آماری مربوط به شاخص­های رویشی بیانگر اثر معنی­دار تیمار روی بر شاخص­های رشد شامل سرعت جوانه­زنی در سطح احتمال (p≤0.05)و سطح برگ، وزن تر، وزن خشک، طول ریشه، طول ساقه، LAR، SLW، LWCA و LWR در سطح احتمال (p≤0.01) بود. همچنین میزان SLA در گیاه لوبیا رقم صیاد تحت تاثیر غلظت­های مختلف نیترات روی قرار نگرفت به­طوری­که نسبت به گروه شاهد تغییرات معنی­داری را نشان نداد.

تغییرات شاخص­های رشد (سرعت جوانه­زنی، طول ریشه، طول ساقه، سطح برگ، وزن تر، وزن خشک تحت تاثیر غلظت­های مختلف روی روند کاهشی را نشان داد(شکل­های7-2).طبق آزمون دانکن مشاهده شد که میزان LWR و LAR گیاه لوبیا رقم صیاد تحت تاثیر غلظت­های مختلف نیترات روی نسبت به گروه شاهد روند افزایشی و SLW و LWCA روند کاهشی داردهمچنین میزان SLA تحت تاثیر غلظت­های مختلف نیترات روی قرار نگرفته
به­طوری که نسبت به گروه شاهد اختلاف معنی داری نداشت(شکل­های13-8).

شاخص­های فیزیولوژیک شامل محتوای کلروفیل و قندهای نامحلول تحت تاثیر غلظت­های مختلف روی روند کاهشی و قندهای محلول روند افزایشی را داشتند (شکل­های 17-14).طبق آزمون مقایسه­ای دانکن، ستون­های مربوط به هر تیمار با حداقل یک حرف مشترک، فاقد اختلاف آماری معنی­دار هستند.

فلز روی یک عنصر ضروری برای گیاهان بوده و

در بسیاری از فرایندهای متابولیکی گیاه نقش دارد و از طریق محافظت پروتئین­ها و لیپید­های غشایی در برابر رادیکال­های آزاد و سایر محصولات حاصل از واکنش­های احیایی درون سلولی سبب حفظ تمامیت غشای سلول­ها می­شود. به­علاوه این فلز به همراه مس بخش اصلی آنزیم سوپراکسید دسموتاز را به­عنوان خنثی­کننده رادیکال­های آزاد تشکیل می­دهد ]30[.نتایج این تحقیق نشان داد که پارامترهای رشد تحت تاثیر نیترات روی به­کار برده شده قرار گرفت
به­طوری­که افزایش غلظت این عنصر باعث کاهش سرعت جوانه­زنی ،کاهش سطح برگ، کاهش وزن ترو خشک برگ، کاهش طول ساقه و ریشه می­شود.

نتایج به دست آمده از تاثیر نیترات روی بر سرعت جوانه­زنی نشان داد که افزایش غلظت نیترات روی باعث کاهش سرعت جوانه­زنی می­شود به­طوری­که هر چه غلظت نیترات روی بیشتر شود سرعت جوانه­زنی کمتر می­شود. به نظر می­رسد عنصر روی در
غلظت­های پایین تاثیر چندانی بر روند جوانه­زنی نداشته باشد.

بر اساس گزارش­هایی در مورد گیاهانی مانند آرابیدوپسیس(Arabidopsis thaliana)، خردل
سفید(Sinapsisalba)،علفهفت­بند((Polygonumaveculare، گندم(Triticumaestivum)و خیار(Cucumissativus) فلزات مس، سرب و روی اثرات سمیت چندانی در مرحله جوانه­زنی گیاهان ندارند]26[.Mahmood و همکاران در سال 2005 ]19[به بررسی تاثیر سطوح مختلف مس و روی بر جوانه­زنی و رشد گیاه ذرت پرداختند. جوانه­زنی تحت تاثیر هیچ یک از تیمارها قرار نگرفت.Peralta و همکاران ]28[دریافتند فلز روی بالعکس نیکل، کروم، مس و کادمیوم اثر معنی­داری در کاهش جوانه­زنی حتی در غلظت­های 40 میلی گرم در لیتر در یونجه(Medicago sativa) نداشت. همچنین روی، مس، کروم و نیکل در غلظت 5 میلی­گرم در لیتر طول ساقه­چه را 7 الی 60 درصد نسبت به شاهد افزایش دادند. آن­ها عنوان کردند که این فلزات در غلظت‌های کم همانند ریزمغذی­ها در گیاه یونجه عمل می­نمایند. در حقیقت بذر مرحله­ای از چرخه زندگی گیاه است که به خوبی در مقابل تنش­های گوناگون گیاه را حفاظت می­کند. اما بلافاصله پس از جذب آب و توسعه رشد رویشی، گیاه به تنش­های محیطی بسیار حساس می­شود.

Malea و همکاران ]20[ با مطالعه اثرات روی بر مرگ و میر سلول­های برگ Halophylastipulecea به این نتیجه رسیدند که این فلز در غلظت­های بالا موجب نکروز سلول­های اپیدرمی و مزوفیلی برگ و مهار رشد سطحی برگ­ها در این گیاه می­شود. تجمع بالای فلزروی در سیتوزول سلول گیاهی نیز از طریق اختلال در عملکرد طبیعی سلول و مهار فرایند تنفس و واکنش­های انرژی­خواه مرتبط با رشد سلول می­تواند سبب کاهش رشد­و­نمو ایده­آل و افت بیومس کل گیاه شود ]9[.

به نظر می‌رسد که فلزات سنگین به روش­های گوناگون مانع رشد گیاهان می­شوند. از یک طرف، فلزات سنگین با کاهش تورژسانس سلول موجبات کاهش تقسیم سلولی و مهار رشد سلول را فراهم
می­آورند]7[ و از طرف دیگر، با تجمع در دیواره سلولی و ورود به سیتوپلاسم و ایجاد اختلال در متابولیسم طبیعی سلول منجر به کاهش رشد می‌­گردند ]23[.

نتایج تحقیق حاضر نشان داد که SLA تحت تاثیر غلظت­های مختلف نیترات روی قرار نگرفت. ولی LWRو LAR تحت تاثیر غلظت­های مختلف نیترات روی روند افزایشی وLWCAو SLWتحت تاثیر غلظت­های مختلف نیترات روی روند کاهشی را نشان دادند. نتایج مشابهی درباره­ی اثرات بازدارندگی فلزات سنگین از جمله نیکل در گیاه گوجه­فرنگی ]27[ ،مس در گیاهBrassica pekinesisRupr]34[ و همچنین سرب و مس در گیاهان Sorghum bicolor،
Zea maysوTriticumaestivum]5[ گزارش شده است.

مهم­ترین علت کاهش رشد در گیاهان تحت تیمار فلزات سنگین ناشی از آسیب­های اکسیداتیو می­باشد. تولید اشکال مختلف اکسیژن فعال تحت القای فلزات سنگین در طی تنش اکسیداتیو، به لیپیدهای غشاء، پروتئین­ها، رنگیزه­ها و اسیدهای نوکلئیک آسیب وارد کرده و منجر به کاهش آشکاری در رشد گیاه می­شود که در نهایت می­تواند منجر به مرگ گیاه هم شود. نتایج پژوهش حاضر با نتایج قاسمی و همکاران ]3[ مطابقت دارد.

تاثیر افزایش غلظت نیترات روی بر میزان کلروفیل در تحقیق حاضر مشهود بود به­طوریکه با افزایش غلظت روی در گیاه میزان کلروفیل کاهش یافت.گزارش شده است که فلزات سنگین بیوسنتز کلروفیل را به­ویژه به­وسیله مهار آمینولوولینیک اسید دهیدروژناز و پروتوکلروفیلایدردوکتاز مهار می­کنند. در کل کاروتنوئیدها کمتر تحت تاثیر فلزات سنگین قرار
می­گیرند و در نتیجه، موجب کمتر شدن نسبت کلروفیل به کاروتنوئید در گیاهان می­شوند علاوه­بر مهار بیوسنتز کلروفیل‌ها به وسیله فلزات سنگین
می­توان به تجزیه زیستی کلروفیل در حضور فلزات سنگین اشاره نمود ]24[.

به نظر می­رسد جایگزین شدن یون منیزیوم مرکزی کلروفیل به­وسیله فلزات سنگین صدمه دیگری است که باعث جلوگیری از به دام انداختن نور فتوسنتزی و در نتیجه از بین رفتن کلروفیل و کاهش فعالیت فتوسنتزی می­شود کاهش محتوای کلروفیل می­تواند دلیلی مستقیم برای کاهش فعالیت فتوسنتزی و در نتیجه کاهش تثبیت کربن در اثر غلظت­های بالای فلزات سنگین باشد ]8[. کاهش ذخیره کلروفیل در برگ­ها به علت مهار مراحل مختلف بیوسنتز کلروفیل است ]1[. به نظر می‌رسد که فلز روی به­عنوان یک فلز سنگین از طریق جلوگیری از انتقال یکسری عناصر ضروری مانند آهن و منیزیوم به کلروپلاست
سلول­های گیاهی در عملکرد این عناصر طی مسیر بیوسنتز کلروفیل در گیاه اختلال ایجاد می­کند ]30[.

Garty و همکاران ]13[ در سال 1992 اثرات فلز روی و تغییرات pH بر تخریب و کاهش کلروفیل در گلسنگ­ها را مورد مطالعه قرار داده و مشاهده کردند که این فلز در غلظت زیاد خود سبب کاهش کلروفیل در گلسنگ­ها می­شود.میشرا و تریپاتی ]22[ در بررسی انباشت کادمیوم در گیاه Baccopamonnieri، گزارش نمودند که پارامترهای بیوشیمیایی نظیر پروتئین، کربوهیدرات و کلروفیل با کاهش مواجه می­شود که با یافته­های حاصل از این پژوهش همسو می­باشند.

طبق تحقیق حاضر افزایش غلظت نیترات روی، باعث افزایش قند محلول شد ولی بر قند نامحلول تاثیر منفی داشته و با افزایش غلظت نیترات روی مقدار قند نامحلول کاهش یافت.می‌­توان گفت که با کاهش مصرف کربوهیدرات­ها برای رشد گیاه که در اثر تنش فلز ایجاد می­شود با تجمع کربوهیدرات­ها مواجه خواهیم بود ]25[. تجمع قندهای محلول در شرایط تنش به تنظیم اسمولاریته سلول کمک می­کند و موجب حفظ و نگهداری مولکول‌های زیستی و غشاها می­گردد ]31[. تغییرات کربوهیدرات­ها به دلیل ارتباط مستقیم­شان با فرایندهای فیزیولوژیکی نظیر فتوسنتز، انتقال و تنفس اهمیت خاصی دارند. در میان کربوهیدرات‌های محلول، ساکارز و فروکتوز در سازگاری با تنش، نقش مهمی ایفا می­کنند ]15[. پژوهش­ها نشان می­دهد که در شرایط تنش شوری، غرقابی، سرما و فلزات سنگین مقدار قندهای محلول افزایش می­یابد ]11،12[. که با تحقیق حاضر مطابقت دارد. گیاهان برای مقابله با تنش اسموتیک ایجاد شده در اثر فلزات سنگین، مکانیسم­های سازشی متفاوتی به­کار می­گیرند. گروهی از گیاهان که مقاومت بالاتری دارند برای حفظ تعادل اسمزی خود تعدادی از متابولیت­های محافظ اسمزی مانند پرولین و کربوهیدرات­های احیاء کننده را افزایش می­دهند ]14[.

روی به­عنوان یک جز تثبیت­کننده غشاهای زیستی در برابر گونه­های فعال اکسیژن و سمیت نقش مهمی را در محتوای کلروفیل- کارتنوئید و فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانت با توجه به زمان دارد ]9[.

افزایش روی باعث افزایش میزان قندها در گیاهان تیمار یافته شد که ممکن است کاهش تنفس و افزایش فعالیت آنزیم­های تجزیه­کننده قندهای غیرمحلول، نظیر انورتاز و سوکروز سنتتاز که منجر به کاهش مصرف قندها از یک طرف و افزایش تولید آنها از طرف دیگر شده است دلیل این امر باشد. گیاهان با افزایش قندهای محلول در شرایط تنش علاوه­بر حفظ پتانسیل اسمزی، قادر خواهند بود تا ذخیره کربوهیدراتی خود را برای متابولیسم پایه سلولی در حد مطلوب نگه­دارند ]12[ همچنین انباشتگی قندهای محلول در سلول می­تواند به علت تجزیه نشاسته به واحدهای کوچکتر و در نتیجه کاهش نشاسته در سلول باشد ]2،4[.