2-نتایج استخراج DNA از نمونههای خون گروه بیمار و کنترل:پس از استخراج DNA از نمونههای خون گروه بیمار و کنترل و تعیین غلظت آن با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومتر، به میزان 1-5/0 میکرولیتر از نمونههای DNA روی ژل آگاروز 1 % الکتروفورز شدند. باندهای تشکیل شده روی ژل آگاروز نشانگر اطمینان از حضور DNA در نمونه بود.
3- نتایج تکثیر پلیمورفیسمهای T1019G و G1272C و G deletions nt 1036 and 1046 در ژن TNP2:قطعه bp 473 از ژن TNP2 حاوی 4 پلیمورفیسم T1019G و G1272C وG deletions nt 1036 and 1046 در گروه بیمار و کنترل با روش PCR تکثیر شد. از هر نمونه PCR شده 5-3 میکرولیتربر روی ژل آگاروز 5/1 % الکتروفورز شد و سپس دراتیدیوم بروماید رنگ شد. تکثیر این ژن نشانگر یک باند منفرد به طول bp 473 در ژل آگاروز بود، که در شکل 1 آورده شده است.
4-نتایج RFLP برای تشخیص پلیمورفیسمهای T1019G و G1272Cدر ژن TNP2:برای بررسی این دو پلیمورفیسم مورد مطالعه از تکنیکPCR – RFLP(هضم آنزیمی با آنزیمهای برش دهنده محصولPCR) استفاده گردید. محصولات هضم آنزیمی در این آزمون در جدول‌های 7 و 8 و شکلهای 2 و 3 آمده است.
شکل 1- نتایج مربوط به تکثیر قطعه bp 473 از ژن TNP2، چاهک1 مارکر با وزن مولکولی bp 100 می‌باشد و چاهک‌های 2و3و5 نمونههای محصول PCR از DNA بیمار و کنترل برای ژن TNP2 ( bp 473 ) می‌باشد وچاهک 4 و 5 به ترتیب نمونه کنترل منفی و کنترل مثبت میباشند.
جدول 7- نتایج مربوط به محصولات هضم آنزیمی برای پلیمورفیسم های مور مطالعه
جدول8. نتایج فراوانی ژنوتیپ‌های پلیمورفیسم T1019G و G 1272 C از ژن TNP2 در گروه بیمارو گروه کنترل
شکل2- محصولات هضم آنزیمی برای پلیمورفیسم T1019G در ژن TNP2، چاهک 2 مارکر ژنتیکی bp 100، چاهک 1 نمونه uncut (bp 437)، چاهک 3 و4 نمونه هموزیگوت وحشی فاقد برش (TT) (bp 437)، نمونه هتروزیگوت برش یافته (TG) (bp 437 و bp353 و bp 120) و نمونه هموزیگوت موتان برش یافته (GG) (bp 353و bp 120) در هیچ یک از نمونههای بیمار و کنترل یافته نشد.
شکل3-محصولات هضم آنزیمی برای پلیمورفیسم G1272C در ژن TNP2، چاهک 5 مارکر ژنتیکی bp 100، چاهک 1 نمونه uncut (فاقد برش) (bp 437)، چاهک 2 نمونه هموزیگوت وحشی فاقد برش(GG) (bp 437)، چاهک 3 نمونه هموزیگوت موتان برش یافته (CC) (bp 375و bp 95) و چاهک 4 نمونه هتروزیگوت برش یافته (GC) (bp 437 و bp375 و bp 95).
5- آنالیز نتایج پلیمورفیسمهایT1019G و
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
ارزش آماری |
فراوانی در گروه کنترل |
فراوانی در گروه بیمار |
نوع الل |
پلی مورفیسم |
نام ژن |
|
P= 0 |
100% 0 |
100% 0 |
T G |
T1019G |
TNP2 |
|
P=0. 6 |
67% 33% |
68.61% 31.37% |
G C |
G 1272 C |
TNP2 |
جدول 10- نتایج فراوانی ژنوتیپ‌ها ی جهش های حذفی گوانین در نوکلئوتیدهای 1036و 1046 در گروه بیمارو گروه کنترل
|
فراوانی در گروه کنترل |
فراوانی در گروه بیمار |
نوع ژنوتیپ |
نام ژن و پلی مورفیسم |
|
0 0 0 |
0 0 0 |
GG G/- -/- |
TNP2 T 1019 G |
|
0 0 0 |
0 0 0 |
GG G/- -/- |
TNP2 G 1272 C |
7-آنالیز نتایج جهشهایحذف گوانین در نوکلئوتیدهای 1036و 1046 در ژن TNP2: نتایج آنالیزآماری پلیمورفیسم حذف گوانین در نوکلئوتیدهای 1036و 1046در ژن TNP2، با مقایسه بین داده‌های دو گروه بیمارو کنترل نشان داد بین این دو گروه اختلاف معنیداری وجود ندارد. بنابراین چنین نتیجه داد که بین حضورپلی‌مورفیسم حذف گوانین در نوکلئوتیدهای1036 و 1046در ژنNP2 با جمعیت مردان نابارور ایرانی و ایجاد اولیگواسپرمی و آزواسپرمی ارتباط معنیداری وجود ندارد (P > 0/05). نتایج آنالیز آماری این پلیمورفیسم در جدول 11 آمده است.
8- نتایج تعیین توالی محصولات PCR: نمونه محصول قطعه PCR برای ژن TNP2تعیین توالی گردید و نتایج تعیین توالی و همولوژی در بلاست آن در شکل 5 آورده شده است.
شکل 4- نتایج SSCP و تشکیل باندهای تک رشته و دو رشته DNA در روی ژل آکریل آمید برای بررسی G deletions nt 1036 and 1046در ژن TNP2، چاهک 1 تا 4 نمونه DNA بیمارو خانه 5 تا 7 نمونه DNA کنترل (تمامی نمونههای گروه بیمار و کنترل دارای الگویی مشابه بودند).
جدول 11- نتایج آنالیز آماری برای دو جهش حذف گوانین در نوکلئوتیدهای 1036و 1046در ژن TNP2 در مقایسه بین دو گروه بیمار و کنترل.
|
ارزش آماری |
فراوانی در گروه کنترل |
فراوانی در گروه بیمار |
نوع الل |
پلی مورفیسم |
نام ژن |
|
P= 0 |
100% 0 |
100% 0 |
G G Deletion |
G deletion in 1036 and 1046 nt |
TNP2 |
TNP2
Homo sapiens TNP2 gene for transition protein 2, complete cds
Length=1547
Score = 771 bits (854), Expect = 0. 0
Identities = 427/427 (100%), Gaps = 0/427 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 16 AGTTTTGATGGGTTGGTTTGATTGGTTAAATATTATCTTAATAGAGTAATATAGAGTAAT 75
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 978 AGTTTTGATGGGTTGGTTTGATTGGTTAAATATTATCTTAATAGAGTAATATAGAGTAAT 1037
Query 76 TGAATAAACAGAGAGAAGAATAGATATCTAGACTAATGGGATAGAATGGGAAAGAAATGT 135
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1038 TGAATAAACAGAGAGAAGAATAGATATCTAGACTAATGGGATAGAATGGGAAAGAAATGT 1097
Query 136 TGAATAAATGAATGGAATGAGTGAACTAATGAATGGGTGGATGACAAATGGAAGGGATAA 195
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1098 TGAATAAATGAATGGAATGAGTGAACTAATGAATGGGTGGATGACAAATGGAAGGGATAA 1157
Query 196 ATGGATGGATACCTGGATTCACATAGGTCAAAAGGACACTGACGGTAGTCTAAACTCTAT 255
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1158 ATGGATGGATACCTGGATTCACATAGGTCAAAAGGACACTGACGGTAGTCTAAACTCTAT 1217
Query 256 CTATGTCCCATATTCAATCACAAATGAGTAGTTGTAAGACCTTACAGGAGGTCAAGGAGG 315
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1218 CTATGTCCCATATTCAATCACAAATGAGTAGTTGTAAGACCTTACAGGAGGTCAAGGAGG 1277
Query 316 TCACTGACTTCATGAAGTGCTCAGCTATTAAAGGTTCCTTTCCCACTCTTATCCCTTAGG 375
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1278 TCACTGACTTCATGAAGTGCTCAGCTATTAAAGGTTCCTTTCCCACTCTTATCCCTTAGG 1337
Query 376 ATGGAAATCCAACTAATGAGACCGCACTCCTTGGCTTGTTCCTGCGTGTTTCACCCAAAG 435
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1338 ATGGAAATCCAACTAATGAGACCGCACTCCTTGGCTTGTTCCTGCGTGTTTCACCCAAAG 1397
Query 436 GAGAAAA 442
|||||||
Sbjct 1398 GAGAAAA 1404
شکل5- نتایج همولوژی در بلاست قطعه تکثیر شده از ژن TNP2 با PCR.
بحث
بر اساس مطالعات انجام شده کمتر از یک سوم دلایل ژنتیکی برای ناباروری هنوز ناشناخته هستند که بنام دلایل ژنتیکی ادیوپاتیک نامیده شده‌اند [1]. با وجود این که فاکتورهای محیطی می‌توانند نقش مهمی در ناباروری مردان داشته باشند، مطالعات امروزه تغییرات ژنتیکی را عامل موثری دراین امر میداند و خصوصا توجه زیادی به علل ناباروری ادیوپاتیک شده است ]1 ، 8 و 22[.
بر این اساس در این تحقیق به بررسی ارتباط پلیمورفیسمهای معمول در ژنهایی که بصورت ادیوپاتیک در ناباروری مردان نقش دارند پرداخته شده است. این پلیمورفیسم ها عبارتند از:
T1019G و G1272C وG deletions nt 1036 and 1046 در ژن TNP2و روشهای مولکولی رایج شاملRFLP SSCP و sequencingدر این بررسی انجام گرفت. برای پلی مورفیسم G1272C در ژنTNP2 (P=0. 6) با فراوانی 37/31% برای الل C در گروه بیمار در مقایسه با گروه کنترل که 33% بدست آمد، تفاوت معنیدار بین گروه بیماران و گروه کنترل مشاهده نشد و نتایج نشان داد که بین آنها با جمعیت مردان نابارور ایرانی و ایجاد اولیگواسپرمی و آزواسپرمی ارتباطی وجود ندارد. پلیمورفیسمهای T1019GوG deletion at nt 1036 and 1046 درژنTNP2در هیچ یک از گروه های بیماران و کنترل مشاهده نشد و دارای فراوانی صفر گزارش شدند، در نتیجه ارتباطی با ناباروری آدیوپاتیک در مردان ایرانی نشان ندادند.
اخیرا مطالعات زیادی در مورد پلیمورفیسم و جهشها در ژن های پروتامین در جمعیت‌های مختلف انجام گرفته است و نتایج متفاوتی از این تحقیقات بدست آمده است و تعدادی از این مطالعات ارتباط معنیداری را بین پلیمورفیسمهای مورد مطالعه در ژن پروتامینها گزارش نموده‌اند ]5، 7، 8، 9 و 15[. بررسی چهار پلیمورفیسم T1019G و G1272C و G deletions nt 1036 and 1046 در ژن TNP2درجمعیت ایرانی و مقایسه حضور آنها در سایر جمعیتها، نتایج متفاوتی را نشان می دهد که ممکن است به دلایل تفاوت مناطق جعرافیایی و آب و هوایی که روی شرایط محیطی و عادات زندگی این افراد تاثیر مستقیم دارد باشد و یا به دلیل تفاوت تعداد افراد مورد بررسی و سن آنها باشد که می تواند در نتایج تحقیق اثر گذار باشد. همچنین ممکن است نوع تغذیه یا ابتلا به بیماریهای خاص و داروهایی که به طور زمینه ایی در بیماران مصرف شده، عاملی برای این تفاوت ها در جمعیت های مختلف مردان باشد که به این موارد پرداخته شده است.
برای ژن TNP2 در NCBI چندین پلیمورفیسم ثبت شده است. ازجمله این پلیمورفیسمها میتوان به T76G, G117C, C301T, C391T, C78T اشاره نمود که توسط ایمکن و همکارانش در سال 2009 در 135 مرد نابارور موروکایی و فرانسوی بررسی شدند و نتایج آنان نشان داد که تفاوت معنیداری با گروه کنترل نداشتند [9]. همچنین دو پلیمورفیسم T1019G و G1272C در جمعیت 282 مرد نابارور ژاپنی بررسی شدند و در نتایج مطالعات انجام گرفته، تفاوت معنیداری با گروه مردان بارورگزارش نشد [15]. در پلی مورفیسم های دسته دیگری از ژن های پروتامینی TP که ژن TNP1 است نیز مطالعاتی صورت گرفته است که مطالعه حیدری و همکارانش در سال 2014 روی 82 مرد نابارور ایرانی نشان داد در 15 مورد پلی مورفیسم T75C در گروه مردان نابارور مشاهده شد در حالیکه در هیچ یک از 80 مرد نرمال گزارش نشد و در نتیجه امکان تاثیر آن بر روند ناباروری مطرح گردید ]6[.
در این تحقیق نیز که به بررسی ارتباط بین چهار پلیمورفیسم در ژن پروتامینی TNP2 با ناباروری مردان ایرانی انجام گرفته است نتایج نشان داد که ارتباط معنیداری بین حضور پلیمورفیسم G1272Cدر ژن TNP2(P=0. 6) با ناباروری مردان وجود ندارد. همچنین پلیمورفیسم T1019Gو دو جهش حذفیG deletion at nt 1036 and 1046درژنTNP2 در هیچ یک از نمونههای مردان نابارورو بارورایرانی یافت نشد و چنین گزارش شد که بین حضور آنها در جمعیت مردان نابارور ایرانی و ایجاد اولیگواسپرمی و آزواسپرمی ارتباطی وجود ندارد.
مطالعات اخیر نشان داده است که ژنهای پروتامین بصورت کلاستر میباشند و بطور اختصاصی در روند اسپرماتوژنز(در تشکیل اسپرم بالغ) درپستانداران نقش دارند، به طوری که تغییرات کوچک در آن ها میتواند اثرات مهمی در تغییر بیان یا تغییر رونویسی و ترجمه این ژنها در پروسه اسپرماتوژنز دارا باشد [ 5 ، 8 و 23]. بنابراین چنین نتیجه گیری می شود که ژنهای پروتامین، ژنهایی اختصاصی و با ساختمان ثابت هستند که برای روند اسپرماتوژنز نرمال ضروری‌اند و حضور پلیمورفیسم و جهشها در این ژن ها میتواند سبب ناباروری مردان گردد. گرچه با توجه به این تحقیق و مطالعات گذشته این اثرات به ندرت سبب ایجاد ناباروری می‌شود ولی حضور این پلیمورفیسمها و همچنین تغییرات اپی ژنتیک که در روند تغییرات پس از ترجمه این ژن ها اعمال می گردد می توانند به عنوان عاملی در تخریب روند اسپرماتوژنز مطرح باشند. همچنین با توجه به دامنه وسیع مطالعات در سال های اخیر و گستردگی مباحث مورد بحث در زمینه‌های ناباروری و تخصصی شدن هر یک از شاخه‌های مربوط به این دانش، لازم است تحقیقات‌ها با روش های جدید و شیوه‌های نوین در بررسی جهشها و پلیمورفیسم ها انجام پذیرد. همچنین برای برآورد نتایج دقیق‌تر و کامل تر شدن آن ها به بررسی در جمعیت های مختلف و هاپلو تایپ های متفاوت پرداخته شود. با توجه به این مسئله که روز به روز بر تعداد این جهشها و پلیمورفیسمهای جدید مرتبط با ناباروری افزوده می‌شود و تکنیکهای‌هایHigh through put و مدرن نیز در این رشته درحال افزایش است لزوم به کارگیری این متد‌ها در این زمینه ضروری است، خصوصا در بررسی‌هایی که به بررسی تعداد زیاد نمونه پرداخته می‌شود. بعنوان مثال روش HRM-RT PCRیا Size Fragmentation Analysis و یا روشهایی که از microRNA ها استفاده می‌شود و با Real Time PCR نتایج بررسی می‌شود میتواند راهگشایی برای مطالعات جامع‌تر و مثمر ثمر‌تری برای آینده باشد. خصوصا در زمینه درمان و فارماکولوژی این مطالعات می‌توانند مکملی بر کارهای گذشتگان باشد.
منابع
[1] Aston K.I., Krausz C., Laface I., Ruiz-Castane E.D.T. 2010. Evaluation of 172 candidate polymorphisms for association with oligozoospermia or azoospermia in a large cohort of men of European descent. Human Reproduction 2010, 5: 1-15.
[2] Dada R., Thilagavathi J., Venkatesh S., Esteves S.C., Agarwa A. 2011. Genetic Testing in Male Infertility. The Open Reproductive Science Journal, 3: 42-56.
[3] El-Toukhy T.P.B. 2002. Male infertility and ICSI. Current Obstetrics and Gynaecology, 12: 276-285.
[4] Ferlin A., Arredi B.C.F. 2006. Genetic causes of male infertility. Reprod Toxicol, 22: 133-141.
[5] Gazouez C., Oriola J., De Mateo S., Vidal-Taboada J.M., Ballesca J.I. 2008. A comman protamine 1 promoter polymorphism (C190A) correlates with abnormal sperm morphology and increased protamine P1/P2 ratio in infertile patients. Journal of Andrology, 29: 540-548.
[6] Heidari M.M., Khatami M., Talebi A.R., Moezzi F. 2014. Mutation analysis of TNP1 gene in infertile men with varicocele. Iran J Reprod, 12(4): 257-262.
[7] Hogarth C., Itman C., Jans D.A. 2005. Regulated nucleocytoplasmic transport in spermatogenesis: a driver of cellular differentiation? Bioessays, 27: 1011-1025.
[8] Iguchi N., Yang S., Lamb D.J. 2006. An SNP in protamine 1: a possible genetic cause of male infertility? J Med Genet, 43: 382-384.
[9] Imken L., Rouba H., EI Houate B., Louanjli N., Barakat A., Chafik A. 2009. Mutations in the protamine locus: association with spermatogenic failure? Molecular Human Reproduction, 7: 1-22.
[10] Jeffreys A.J. 2013. The man behind the DNA fingerprints: an interview with Professor Sir Alec Jeffreys. Investigative Genetics, 4(21): 1-7.
[11] Katherine L., Varghes A.C., Agarwa A. 2010. The genetic causes of male factor infertility. Fertility and Sterility, 93(1): 1-12.
[12] Kempisty B., Depa-Martynow M., Lianeri M., Jedrzegczak P., Darul-Wasowicz A. 2007. Evaluation of protamines 1 and 2 transcript contents in spermatozoa from asthenozoospermic men. Folia Histochemica ET Cytobiologica, 45: 109-113.
[13] Konstantinos K.V., Panagiotis P., Antonios V.T., Agelos P., Argiris N.V. 2008. PCR–SSCP: A Method for the Molecular Analysis of Genetic Diseases. Mol Biotechnol, 38: 155–163.
[14] Lewin J.D., Abbott D.W.J. 2003. A haploid affair: core histone transitions during spermatogenesis. Biochem Cell Biol,, 81: 131-140.
[15] Miyagawa Y., Nishimura H., Tsujimura A., Matsuoka Y., Matsumiya K., Okuyama A., Nishimune Y.H.T. 2005. Single-nucleotide polymorphisms and mutation analyses of the TNP1 and TNP2 genes of fertile and infertile human male populations. Journal of Andrology, 26(6): 779-786.
[16] Oliva R. 2006. Protamines and male infertility. Human Reproduction Update, 12(4): 417-435.
[17] Park Sh. 2016. Genetic Factors and Environmental Factors Affecting Male Infertility. International Research Journal of Advanced Engineering and Science, 1(3): 115-118.
[18] Poongothai J., Gopenath T.S., Manonayaki S. 2009.Genetics of human male infertility. Singapore Med J, 50(4): 336-347.
ابتدای صفحه