نوع مقاله: مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه میکروبیولوژی،دانشکده علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی ،واحد تهران شمال، تهران، ایران
2 گروه ژنتیک پزشکی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری ،تهران ، ایران
3 گروه ژنتیک مولکولی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران.
چکیده
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Protamines are DNA-binding proteins in the sperm nucleus, which cause differentiation of human spermatogenesis. Protamines required for packaging nucleus sperm by replacement of histones with protamines. Sperm protamine deficiency has been associated with spermatogenesis failed and caused male infertility. In this study association of four SNPs in TNP2 gene were studied in Iranian idiopathic infertile men with azoospermia or oligospermia. Analysis of four SNPs include T1019G, G1272C، G deletion at 1036 and 1046 in TNP2 gene was performed by DNA extraction from blood samples of 96 idiopathic infertile men with azoospermia or oligospermia and 100 normal control men. Then using restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) for detection of T1019G and G1272C, SNPs and for identification of G deletion at 1036 and 1046 used Single Strand Conformation Polymorphism (PCR- SSCP). Results were confirmed by DNA sequencing analysis. For (G1272C) in TNP2 gene, frequency of CC genotype was differented in fertile and infertile groups but statistical analysis showed no significant association related to this SNP in case and control groups. As also no polymorphisms were found for T1019G and G deletion at 1036 and 1046 nt. These results are consistent with previous studies and indicating that four tested SNPs was not associated with oligospermia and azospermia and idiopatic male infertility in Iranian population.
کلیدواژهها [English]
ناباروری از دیدگاه کلینیکی به مفهوم ناتوانی در بارداری بعد از 12 ماه آمیزش طبیعی بدون استفاده از وسائل جلوگیری کننده از بارداری میباشد. تقریبا از هر شش زوج یک زوج به این مشکل دچار هستند که در حدود 50 درصد از موارد به دلیل ناباروری در مردان[1] است[3]. برآوردها نشان میدهد که نیمی از موارد ناباروری به طور کامل و یا تا حدود زیادی به دلیل ناهنجاری و اختلال در اسپرم است که باعث میشود ناباروری مردان به عنوان یکی از شایعترین علل ناباروری در نظر گرفته شود [3].
ناحیه تعیین جنسیت در کرموزوم Y(SRY)[2] در بازوی کوتاه این کروموزوم (Yp) قرار دارد، در حالیکه ژنهای کنترل کننده اسپرماتوژنز در قسمت میانی بازوی بلند (Yq) قرار دارند. چرخه 70 روزه اسپرماتوژنز بوسیله سلولهای سرتولی در تبولهای اسپرم بر[3] تغذیه میشود. در میان سلولهای سرتولی، سلولهای اسپرماتوگنی قرار دارند که طی تقسیم میتوز به اسپرماتوسیتها و سپس طی تقسیم میوز به اسپرماتیدهای گرد هاپلوئید تبدیل میشوند. اسپرماتیدهای گرد، طویل شده و سپس به اسپرماتوزوآی دارای فلاژلتبدیل شده و تمایز پیدا میکند. اسپرماتوزوآ در طی یک دوره 14-2 روزه ضمن عبور از اپیدیدیم، محلی که در آن پتانسیل بارورسازی را پیدا میکند، بطور کامل بالغ میشود. کنترل هورمونی بر فرآیند اسپرماتوژنز بوسیله هیپوتالاموس و غده هیپوفیز و از طریق آزادسازی هورمون GnRH و بهدنبال آن آزادسازی FSH[4]و LH[5]هماهنگ میشود. به علاوه میزان محلی تستوسترون که بوسیله سلولهای لایدیگ تولید و ترشح میشود، 100 برابر بیشتر از میزان آن در سرم است [3].
اسپرماتوژنز یک فرآیند پیچیده میباشد که تحت تاثیر ژنهای زیادی قرار دارد و مکانیسمهای مولکولی دخیل در حال مطالعه میباشند[11]. بنا بر تخمینهای موجود در حدود 2000 ژن این فرآیند را کنترل مینمایند که بیشتر آنها بر روی کروموزومهای آتوزوم قرار دارند و در حدود 30 ژن نیز روی کرموزوم yواقع شدهاند. در حالیکه ژنهای آتوزومی با تنظیم فرآیندهای متابولیک در سایر سلولهای بدن نیز ارتباط دارند [11 و 2]. از مهمترین عوامل ناباروری میتوان به اختلال در تعداد، حرکت و مورفولوژی اسپرم و اختلالات ساختمانی، عدم تعادل هورمونی و عوامل ژنتیکی که درایجاد ناباروری مردان دخالت دارند، اشاره نمود ]11 و 21 و 24]. عوامل ژنتیکی موثر در ناباروری مردان که تا به امروز مشخص شدهاند عبارتند از: اختلالات کرموزومی، بیماریهای تک ژنی، اختلال در میوز و اندوکرین[11 و 17 و 24].
علی رغم تمام عوامل ذکر شده، 25% از مردان نابارور دارای آنالیز اسپرم غیر طبیعی هستند که هیچ اتیولوژی برای آنها شناسایی نشده است [4 و 11[. این حالت را بنام ناباروری ادیوپاتیک مردان مینامند، که با دلایل ژنتیکی متعددی مشخص میشوند ]17 و 18 و 19[. پارامترهای اسپرم در 39% از این بیماران دامنه وسیعی از اختلالات را نشان میدهد و در حدود 2% از بیماران یک اولیگواسپرمی ادیوپاتیک عنوان میشود. نقایص در حرکت و فعالیت اسپرم در 24% ازبیماران وجود دارد و در 10% از بیماران اختلالات ساختمانی اسپرم مشاهده میشود. تاریخچه پزشکی و معاینه فیزیکی و آزمایشات هورمونی در بیماران معمولا نرمال است و گاهی فقط افزایش خفیف هورمون FSH مشاهده میشود که دلیل اختلال در اسپرماتوژنز نمیباشد [4 و 11]. از شایعترین عوامل ادیو پاتیک، اختلالات در هسته سلول اسپرم و تغییر ساختمان DNA آن میباشد [16 و 23].
در اسپرماتیدهای تمام گونهها، هیستونها
پروتئینهای کروموزومال اصلی هستند. هیستونها دارای توده کلی برابر با DNA در یوکاریوتها هستند و پنج نوع اصلی دارند: H1,H2a,H2b,H3,H4.علاوه بر این پنج هیستون سوماتیک، بعضی از پستانداران دارای هیستون مخصوص بیضهای نیز هستند (Testis specific Histones) [11 و 16]. همچنین پروتامینها به عنوان جایگزین هیستونها در مراحل تکوین هسته اسپرم ایفاینقش مینمایند و نشان داده شده است که ژنهایروی بازوی بلند کروموزوم 16 نقشی اساسی در این فرآیند جانشینی دارند ووجود برخی پلیمورفیسم و جهش درآنها
میتواند با ناباروری مردان ارتباط داشته باشد [5 و 9 و 20]. در واقع لوکوس مولتی ژنی در ناحیهای به طول 28 کیلو باز روی کروموزوم 16 درروند اسپرماتوژنز با ایجاد آزواسپرمی و اولیگواسپرمی در مردان دخالت دارد [5 و 9 و 20]. مهمترین نقش پروتامینها متراکم نمودن کروماتینها در هسته سر اسپرم میباشد که این افزایش تراکم کروماتینها عامل ناباروری مردان میگردد [6 و 15 و 20]. این ژن ها در ناحیهایی به طول 28 کیلو باز روی بازوی بلند کروموزوم 16بصورت یک لوکوس مولتی ژنیک که به صورت هماهنگ و متوالی بیان میشوند، قرار گرفتند. این ژنها پروتئینهای اختصاصی اسپرم (پروتامینها) را تولید مینمایند. پروتامینها از اصلیترین و
کوچکترین پروتئینهای هسته اسپرم هستند که بین گونههای مختلف دارای ساختمان ثابت میباشند ] 9 و 12 و 22[. این پروتئینها غنی ازاسید آمینههای آرژنین و سیستئین هستند، که برای تشکیل باندهای DNA و پلهای دی سولفیدی در هسته اسپرم مورد نیازند.
کلاساول از پروتامینها، PRM پروتئینها
میباشند و کلاس دوم از پروتئینهای پروتامین اصطلاحاپروتئینهایگذرایاTP(Transition proteins)نام دارند که کاملا جانشین هیستونها میگردند. در پستانداران دو نوع اصلی دارند: TP1, TP2 وجود دارند [6 و 15 و 16]. این پروتئینها با DNA تشکیل نوکلئوزوم نمیدهند و باید ابتدا نوکلئوزومها و هسته هیستون از حالت ترکیب بیرون آیند. در اسپرماتید متراکم و بالغ، پروتئینهای پروتامین، جایگزین پروتئینهای گذرا شده و با DNA ژنومی همراه میشوند. ترکیب پروتامین و DNA که بسیار متراکم و ثابت میباشند، بوسیله باندهای دی سولفیدی بین پروتامینها ثبات بیشتری پیدا میکند [5 و 6 و 15 و 16]. این ساختمان بسیار متراکم و دارای زنجیرههای جانبی نسبت به بسیاری از آسیبهای خارجی که باعث نابودی بستههای DNA در حال میتوز میشوند، نفوذ ناپذیر است. بدین ترتیب هسته اسپرم در برابر اولتراسوند، هضم تریپسین، هضم آنزیمی DNase، مواد شوینده و درمان با داروهای خاص که باعث حل شدن اجزای سلولی میشوند، مقاوم شده و ثبوت خود را حفظ میکند. DNA ژنومی به میزان زیادی در اسپرم بالغ فشرده شده است و این درهم رفتن و
بستهبندی DNA به کمک ماتریکس هسته و پروتامینها انجام میگیرد [11 و 16]. علاوه بر این کمپلکس پروتامین-DNA، یک رشته DNA با شکاف بزرگتر به رشته مجاور اتصال مییابد، بطوریکه رشتههای DNA درون هسته اسپرم به صورت ردیف خطی و پهلو به پهلو بستهبندی میشوند. بر همین اساس کروماتین به وسیله باندهای کووالان دی سولفیدی هم در درون و هم در بین رشتههای DNA محکم و ثابت میشود. مسئله اساسی بروز فعال ژن هنگام در هم رفتن و فشرده شدن DNA هسته اسپرم است. تغییرات مورفولوژیک درطی اسپرمیوژنز و تغییرات در پروتئینهای پایهای کروموزومال، پروسههای پیچیدهایی هستند که شامل بروز صدها ژن در زمانهای گوناگون میشوند. هم در نسخه برداری و هم در ترجمه درون اسپرم عمل کنترل ژنی وجود دارد، در مورد تمامی ژنهای پروتامین، بلافاصله پس از میوز نسخهبرداری میشوند. همچنین یک هفته بعد نیز هنگام تجمع بصورت DNA ژنومی ترجمه میشوند. از آنجا که همانند سازی DNA و یا نسخه برداری RNA در اسپرماتیدهای بالغ و متراکم صورت نمیگیرد این اعمال باید در مراحل اولیه اسپرمیوژنز برای تولید پروتئینهای پروتامینها که در مراحل بعدی برای بستهبندی DNA مورد نیاز هستند، انجام گیرد [7 , 14 , 16]. با شواهدی که از مطالعات روی ژنهای پروتامینها بدست آمده است، این موضوع مطرح شده که اگر ترتیب و ردیف موقتی از ترجمه پروتامین تغییر یابد، شکلهای غیر طبیعی هسته و حتی توقف کامل اسپرماتوژنز میتواند القا شود ] 23[.
بنابر گزارشات متعدد درمواردی وجود پلیمورفیسم یا جهش خاص در این ژنها سبب ناباروری مردان میشود، که در این تحقیق برای اولین بار ارتباط چهار پلیمورفیسم در ژن TNP2 شامل T1019G، G1272C،G deletion at 1036 and 1046 با ناباروری مردان ایرانی بررسی شده است. در این ژن دو پلیمورفیسم T1019G و G1272C با استفاده از روش PCR- RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) و پلیمورفیسمهای
G deletion nt 1036 and 1046 با روش
PCR- SSCP (Single Strand ConformationPolymorphism) مورد بررسی قرار گرفتند.
روش RFLP یکی از راههای بررسی وجود پلیمورفیسمها و جهشهای نقطهای، با استفاده از آنزیمهای محدودالاثر میباشد. تغییر یک نوکلئوتید میتواند جایگاه اثری برای یک آنزیم بوجود آورد و سبب ایجاد قطعات کوچکتر از قطعه ژن مورد نظر در نمونه DNA دارای آن تغییر گردد. در موارد دیگر میتواند جایگاه اثری برای یک آنزیم را از بین ببردو سبب شود آن آنزیم قادر به برش دادن توالی ژن مورد نظر در محل دارای تغییر نوکلئوتیدی مورد بررسی نباشد. در هر دو حالت فوق، نمونه DNA-ایی که دارای تغییر نوکلئوتیدی است اگر تحت اثر آنزیم محدودالاثر ویژه قرار گیرد در مقایسه با سایر نمونههای معمول الگوی برش متفاوتی نشان میدهد]10[.
تکنیک SSCP تکنیک دیگری برای تشخیص
پلی مورفیسمها خصوصا حذفهای نوکلئوتیدی است و قادر به تشخیص تغییر، حتی در یک عدد باز میباشد. در این روش تک رشته DNA قادر به اتصال با خودش بوده که منجر به تشکیل یک شکل فضائی (ساختمان سوم) میگردد. ساختمان سوم یک قطعه DNA تک رشته بستگی به توالی بازی قطعه مورد نظر دارد و وقوع جهش در یک قطعه مشخص معمولاً منجر به تغییر شکل فضایی[6]DNA تک رشته واجد جهش نسبت به DNA تک رشته وحشی یا نرمال میگردد ]13[. در پایان برای تایید نتایج حاصل
نمونههایی با روش Sequencing تعیین توالی و بررسی شدند.
مواد و روشها
1- نمونهگیری:گروه بیمار از بین مردان ناباروری که به دلایل علل ناشناخته ژنتیکی، نابارور ادیوپاتیک تشخیص داده شده بودند، 96 نفر انتخاب شدند. این مردان دو زیر گروه، آزواسپرم که فاقد اسپرم و 77 نفر بودند و اولیگو اسپرم که دارای کمتر از پنج میلیون سلول اسپرم در میلیلیتر و 19 نفر بودند، را شامل میشدند. این مردان در گروه سنی 30-45 سال قرار داشتند. گروه کنترل شامل 100 نفراز مردان بارور سالم بود، که درگروه سنی مشابه قرار داشتند و از نظر پارا مترهای فیزیولوژی و ساختمانی و نتایج کاریو تایپینگ دارای حالت نرمال بودند و دارای حداقل یک فرزند بودند. برای نمونهگیری، از کلیه افراد 5 میلی لیتر خون محیطی در فالکونهای حاوی 500 میکرولیتر محلول آنتی کوالانت EDTA (20 میلی مولار باPH=8 و میزان 100میکرولیتر به ازاء هر یک میلیلیتر خون محیطی) گرفته شد. نمونههای خون تا زمان استخراج DNA از هسته گلبولهای سفید خون در دمای C˚20- نگهداری شدند.
2- استخراج DNA:برای استخراج DNA ژنومیک از خون، روش استخراج نمکی DNAانجام گرفت و ازمواد و محلولهای زیر استفاده شد.بافر لیز کننده گلبولهای قرمز - بافر P - سدیم دو دسیل سولفات(SDS) 10 درصد- پروتئیناز K باغلظت mg/ml 20- کلرید سدیم (Nacl) 6 مولار- اتانل 100%- اتانل 70%- بافر TE.
3-انجام PCR برای پلیمورفیسمهای مورد مطالعه:واکنش PCRبرای هرتکثیر هریک از پلیمورفیسمهای T1019G، G1272CوG deletion at 1036 and 1046 در ژن TNP2انجام گرفت. مشخصات ژن و پلیمورفیسمهای مورد مطالعه در جدول 1 آمده است. همچنین مواد مورد نیاز برای PCR و مشخصات پرایمرها و برنامه دستگاه PCR برای تکثیر پلیمورفیسمهای مذکور به ترتیب در جداول 2 و 3 و 4 آورده شده است.
جدول 1- مشخصات پلیمورفیسم های مورد مطالعه
نام ژن |
ID ژن |
محل ژن |
نام SNP |
محل پلیمورفیسم |
TNP2 |
7142 |
Ch 16p13. 13 |
T1019G G1272C G deletion in 1036 and 1046 |
Rs 2857758 Rs 8043625 L03378 |
جدول 2- مواد مورد نیاز برای واکنش PCR
مواد مورد نیاز |
حجم |
آب مقطر دونیزه |
19 میکرولیتر |
بافر PCR |
5/2 میکرولیتر |
Mgcl2 |
1 میکرولیتر |
dNTP |
5/0 میکرولیتر |
هر یک از پرایمرهای راست و چپ |
5/0 میکرولیتر |
DNA ژنومی نمونه مورد نظر |
2/1-1 میکرولیتر |
آنزیم Taq پلیمراز |
2/0 میکرولیتر |
حجم نهایی |
25 میکرو لیتر |
جدول 3- مشخصات پرایمرهای مورد استفاده در انجام PCR در این مطالعه
منابع مورد استفاده |
توالی پرایمرها |
نام ژن |
*با استفاده از برنامه SNP cutter بدست آمد. |
F- gtggttggtggatgaattggttag R- ttctcctttgggtgaaacacgcag |
TNP2
|
جدول4- برنامه PCR برای تکثیر پلیمورفیسم های مورد مطالعه
نام ژن |
دناتوره شدن دما - زمان |
اتصال آغازگر دما - زمان |
سنتز DNA دما - زمان |
تعداد سیکل PCR |
طول قطعه تکثیر شده bp |
TNP2 |
°C94-1دقیقه |
°C57-1دقیقه |
°C72-1دقیقه |
32 |
473 |
جدول 5- قطعات ناشی از هضم آنزیمی محصولات PCR بدنبال استفاده از روش RFLP جهت تعیین پلیمورفیسم های مورد مطالعه.
ژن |
پلیمورفیسم |
آنزیم |
سایت برش |
برش اللی |
طول PCR |
طول قطعات حاصل بعد از برش |
TNP2 |
T 1019 G |
Ear I |
C/TCTTC |
الل جهش یافته |
473 |
473 و 353 و 120 |
TNP2 |
G 1272 C |
Hind III |
AA/GCTT |
الل جهش یافته |
473 |
473 و 279 و 94 |
6-انجام روشSSCP برای تشخیص پلیمورفیسمها:پس از انجام PCR، بررسی حضور دو پلی مورفیسم حذف نوکلئوتید G در موقعیت 1036 و 1046 توالی نوکلئوتیدی ژن TNP2، از روش SSCP انجام گرفت. در این تکنیک روش کار و مواد مورد استفاده عبارت بودند از:ابتدا محلول آکریل آمید جهت الکتروفورز محصولات PCR ژن TNP2 با طول قطعه بیش از bp 200 از ژل SSCP با 8% اکریلامید استفاده شد. برای تهیه این ژل محلول اکریلامید - بیس اکریلامید، بافر TBE 5X، آب دو بار تقطیر،APS 10% و TEMEDبه کار برده شد. پس از تهیه محلول ژل SSCP سریعا در فاصله دو شیشه ریخته شد. ژل 2-1 ساعت به ولتاژ 200-100متصل شد و سپس نمونههای محصول PCR که با بافر مخصوص SSCP بارگیری شده بودندو به مدت 10 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد قرار داده شده بودند بر روی یخ منتقل شده و پس از گذشت 5 دقیقه نمونهها به چاهکهای ژل انتقاال داده شدند. ابتدا ژل در دمای 4درجه سانتیگراد با ولتاژ 170 ولت بهمدت 2-1 ساعت الکتروفورز شد و سپس با ولتاژ 60 یک شب الکتروفورز شدند. بعد از اتمام الکتروفورز ژل اکریل امید با روش نیترات نقره رنگآمیزی شد.
نتایج
1- گروه بیماران:گروه بیمار مردان نابارور دارای نقص در روند اسپرماتوژنزیز را شامل میشدند. این افراد توسط پزشک متخصص اورولوژی مورد بررسی قرار گرفتند. با انجام یک سری آزمایشات اندرولوژی روی بیماران شامل بررسی تاریخچه پزشکی، معاینات فیزیکی، آنالیز مایع سیمن، آنالیز هورمونی برای میزان LH, FSH، بررسی کاریوتایپ بیماران و در برخی موارد بیوپسی بیضه صورت گرفت. از بین مردان ناباروری که برای درمان مراجعه کرده بودند و آزمایشات ذکر شده را انجام داده بودند، 25% بیمارانی بودند که دارای اختلال در تعداد، حرکت و ساختمان اسپرم بودند بدون آنکه اتیولوژی خاصی را نشان دهند و از نظر آزمایشات انجام شده و کاریوتایپ مشکلی نداشتند. در این افراد علل ژنتیکی ناشناخته علت ناباروری گزارش گردید. به این ترتیب که گروهی فاقد اسپرم بودند که در گروه آزواسپرمی گروه بندی شدند و در گروهی تعداد اسپرم کمتر از پنج میلیون سلول اسپرم در میلی لیتر بود که در گروه اولیگواسپرم قرار گرفتند. برای این تحقیق 96 نفر از مردان بررسی شده فوق که دارای ناباروری با دلایل ژنتیکی متعدد و گاه ناشناخته گزارش شدند و در گروه مردان نابارور ادیوپاتیک قرارگرفتند، انتخاب شدند. از این مردان 77 نفر آزواسپرم و 19 نفر اولیگواسپرم بودند و در گروه سنی 45-30 قرار داشتند. گروه کنترل از 100 نفر مرد سالم و باروری که در شرایط سنی و موقعیت جغرافیایی مشابه با گروه بیمار قرار داشتند، انتخاب شدند. نتایج دموگرافی افراد مورد مطالعه در جدول 6 آورده شده است.
جدول 6- دموگرافی گروه بیمار و کنترل در این مطالعه
افراد مورد مطالعه |
گروه بیمار ازو اسپرم + اولیگواسپرم |
گروه کنترل سالم و نرمواسپرم |
تعداد |
96 = 77 + 19 |
100 |
گروه سنی |
(57/4 ± 04/37 ) 45-37 |
(31/5 ± 92/37 ) 45-26 |
تعداد اسپرم |
0برای آزواسپرمهاکمتر از 106×5 برای اولیگواسپرمها |
بیشتر از106×20 |
حرکت اسپرم |
0 |
بیشتر از 50% |
مورفولوژی اسپرم |
0 |
بیشتر از 30% |
4-نتایج RFLP برای تشخیص پلیمورفیسمهای T1019G و G1272Cدر ژن TNP2:برای بررسی این دو پلیمورفیسم مورد مطالعه از تکنیکPCR – RFLP(هضم آنزیمی با آنزیمهای برش دهنده محصولPCR) استفاده گردید. محصولات هضم آنزیمی در این آزمون در جدولهای 7 و 8 و شکلهای 2 و 3 آمده است.
شکل 1- نتایج مربوط به تکثیر قطعه bp 473 از ژن TNP2، چاهک1 مارکر با وزن مولکولی bp 100 میباشد و چاهکهای 2و3و5 نمونههای محصول PCR از DNA بیمار و کنترل برای ژن TNP2 ( bp 473 ) میباشد وچاهک 4 و 5 به ترتیب نمونه کنترل منفی و کنترل مثبت میباشند.
جدول 7- نتایج مربوط به محصولات هضم آنزیمی برای پلیمورفیسم های مور مطالعه
طول قطعات ایجاد شده با آنزیم |
نوع ژنوتیپ |
نام آنزیم |
طول محصول PCR |
نام پلیمورفیسم |
نام ژن |
473bp 473bp, 353bp, 120bp 353bp, 120bp |
TT TG GG |
EarI |
473 bp |
T 1019 G |
TNP2 |
473bp 473bp, 378bp, 95bp 378bp, 95bp |
GG GC CC |
HindIII |
473 bp |
G 1272 C |
TNP2 |
جدول8. نتایج فراوانی ژنوتیپهای پلیمورفیسم T1019G و G 1272 C از ژن TNP2 در گروه بیمارو گروه کنترل
فراوانی در گروه کنترل |
فراوانی در گروه بیمار |
نوع ژنوتیپ |
نام ژن و پلی مورفیسم |
100% 0 0 |
100% 0 0 |
TT TG GG |
TNP2 T 1019 G |
50% 33% 17% |
51% 36.5% 12.5% |
GG GC CC |
TNP2 G 1272 C |
شکل2- محصولات هضم آنزیمی برای پلیمورفیسم T1019G در ژن TNP2، چاهک 2 مارکر ژنتیکی bp 100، چاهک 1 نمونه uncut (bp 437)، چاهک 3 و4 نمونه هموزیگوت وحشی فاقد برش (TT) (bp 437)، نمونه هتروزیگوت برش یافته (TG) (bp 437 و bp353 و bp 120) و نمونه هموزیگوت موتان برش یافته (GG) (bp 353و bp 120) در هیچ یک از نمونههای بیمار و کنترل یافته نشد.
شکل3-محصولات هضم آنزیمی برای پلیمورفیسم G1272C در ژن TNP2، چاهک 5 مارکر ژنتیکی bp 100، چاهک 1 نمونه uncut (فاقد برش) (bp 437)، چاهک 2 نمونه هموزیگوت وحشی فاقد برش(GG) (bp 437)، چاهک 3 نمونه هموزیگوت موتان برش یافته (CC) (bp 375و bp 95) و چاهک 4 نمونه هتروزیگوت برش یافته (GC) (bp 437 و bp375 و bp 95).
جدول 9- نتایج آنالیز آماری برای دو پلیمورفیسم مورد مطالعه در مقایسه بین دو گروه بیمار و کنترل.
ارزش آماری |
فراوانی در گروه کنترل |
فراوانی در گروه بیمار |
نوع الل |
پلی مورفیسم |
نام ژن |
P= 0 |
100% 0 |
100% 0 |
T G |
T1019G |
TNP2 |
P=0. 6 |
67% 33% |
68.61% 31.37% |
G C |
G 1272 C |
TNP2 |
جدول 10- نتایج فراوانی ژنوتیپها ی جهش های حذفی گوانین در نوکلئوتیدهای 1036و 1046 در گروه بیمارو گروه کنترل
فراوانی در گروه کنترل |
فراوانی در گروه بیمار |
نوع ژنوتیپ |
نام ژن و پلی مورفیسم |
0 0 0 |
0 0 0 |
GG G/- -/- |
TNP2 T 1019 G |
0 0 0 |
0 0 0 |
GG G/- -/- |
TNP2 G 1272 C |
8- نتایج تعیین توالی محصولات PCR: نمونه محصول قطعه PCR برای ژن TNP2تعیین توالی گردید و نتایج تعیین توالی و همولوژی در بلاست آن در شکل 5 آورده شده است.
شکل 4- نتایج SSCP و تشکیل باندهای تک رشته و دو رشته DNA در روی ژل آکریل آمید برای بررسی G deletions nt 1036 and 1046در ژن TNP2، چاهک 1 تا 4 نمونه DNA بیمارو خانه 5 تا 7 نمونه DNA کنترل (تمامی نمونههای گروه بیمار و کنترل دارای الگویی مشابه بودند).
جدول 11- نتایج آنالیز آماری برای دو جهش حذف گوانین در نوکلئوتیدهای 1036و 1046در ژن TNP2 در مقایسه بین دو گروه بیمار و کنترل.
ارزش آماری |
فراوانی در گروه کنترل |
فراوانی در گروه بیمار |
نوع الل |
پلی مورفیسم |
نام ژن |
P= 0 |
100% 0 |
100% 0 |
G G Deletion |
G deletion in 1036 and 1046 nt |
TNP2 |
TNP2
Homo sapiens TNP2 gene for transition protein 2, complete cds
Length=1547
Score = 771 bits (854), Expect = 0. 0
Identities = 427/427 (100%), Gaps = 0/427 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 16 AGTTTTGATGGGTTGGTTTGATTGGTTAAATATTATCTTAATAGAGTAATATAGAGTAAT 75
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 978 AGTTTTGATGGGTTGGTTTGATTGGTTAAATATTATCTTAATAGAGTAATATAGAGTAAT 1037
Query 76 TGAATAAACAGAGAGAAGAATAGATATCTAGACTAATGGGATAGAATGGGAAAGAAATGT 135
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1038 TGAATAAACAGAGAGAAGAATAGATATCTAGACTAATGGGATAGAATGGGAAAGAAATGT 1097
Query 136 TGAATAAATGAATGGAATGAGTGAACTAATGAATGGGTGGATGACAAATGGAAGGGATAA 195
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1098 TGAATAAATGAATGGAATGAGTGAACTAATGAATGGGTGGATGACAAATGGAAGGGATAA 1157
Query 196 ATGGATGGATACCTGGATTCACATAGGTCAAAAGGACACTGACGGTAGTCTAAACTCTAT 255
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1158 ATGGATGGATACCTGGATTCACATAGGTCAAAAGGACACTGACGGTAGTCTAAACTCTAT 1217
Query 256 CTATGTCCCATATTCAATCACAAATGAGTAGTTGTAAGACCTTACAGGAGGTCAAGGAGG 315
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1218 CTATGTCCCATATTCAATCACAAATGAGTAGTTGTAAGACCTTACAGGAGGTCAAGGAGG 1277
Query 316 TCACTGACTTCATGAAGTGCTCAGCTATTAAAGGTTCCTTTCCCACTCTTATCCCTTAGG 375
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1278 TCACTGACTTCATGAAGTGCTCAGCTATTAAAGGTTCCTTTCCCACTCTTATCCCTTAGG 1337
Query 376 ATGGAAATCCAACTAATGAGACCGCACTCCTTGGCTTGTTCCTGCGTGTTTCACCCAAAG 435
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1338 ATGGAAATCCAACTAATGAGACCGCACTCCTTGGCTTGTTCCTGCGTGTTTCACCCAAAG 1397
Query 436 GAGAAAA 442
|||||||
Sbjct 1398 GAGAAAA 1404
شکل5- نتایج همولوژی در بلاست قطعه تکثیر شده از ژن TNP2 با PCR.
بحث
بر اساس مطالعات انجام شده کمتر از یک سوم دلایل ژنتیکی برای ناباروری هنوز ناشناخته هستند که بنام دلایل ژنتیکی ادیوپاتیک نامیده شدهاند [1]. با وجود این که فاکتورهای محیطی میتوانند نقش مهمی در ناباروری مردان داشته باشند، مطالعات امروزه تغییرات ژنتیکی را عامل موثری دراین امر میداند و خصوصا توجه زیادی به علل ناباروری ادیوپاتیک شده است ]1 ، 8 و 22[.
بر این اساس در این تحقیق به بررسی ارتباط پلیمورفیسمهای معمول در ژنهایی که بصورت ادیوپاتیک در ناباروری مردان نقش دارند پرداخته شده است. این پلیمورفیسم ها عبارتند از:
T1019G و G1272C وG deletions nt 1036 and 1046 در ژن TNP2و روشهای مولکولی رایج شاملRFLP SSCP و sequencingدر این بررسی انجام گرفت. برای پلی مورفیسم G1272C در ژنTNP2 (P=0. 6) با فراوانی 37/31% برای الل C در گروه بیمار در مقایسه با گروه کنترل که 33% بدست آمد، تفاوت معنیدار بین گروه بیماران و گروه کنترل مشاهده نشد و نتایج نشان داد که بین آنها با جمعیت مردان نابارور ایرانی و ایجاد اولیگواسپرمی و آزواسپرمی ارتباطی وجود ندارد. پلیمورفیسمهای T1019GوG deletion at nt 1036 and 1046 درژنTNP2در هیچ یک از گروه های بیماران و کنترل مشاهده نشد و دارای فراوانی صفر گزارش شدند، در نتیجه ارتباطی با ناباروری آدیوپاتیک در مردان ایرانی نشان ندادند.
اخیرا مطالعات زیادی در مورد پلیمورفیسم و جهشها در ژن های پروتامین در جمعیتهای مختلف انجام گرفته است و نتایج متفاوتی از این تحقیقات بدست آمده است و تعدادی از این مطالعات ارتباط معنیداری را بین پلیمورفیسمهای مورد مطالعه در ژن پروتامینها گزارش نمودهاند ]5، 7، 8، 9 و 15[. بررسی چهار پلیمورفیسم T1019G و G1272C و G deletions nt 1036 and 1046 در ژن TNP2درجمعیت ایرانی و مقایسه حضور آنها در سایر جمعیتها، نتایج متفاوتی را نشان می دهد که ممکن است به دلایل تفاوت مناطق جعرافیایی و آب و هوایی که روی شرایط محیطی و عادات زندگی این افراد تاثیر مستقیم دارد باشد و یا به دلیل تفاوت تعداد افراد مورد بررسی و سن آنها باشد که می تواند در نتایج تحقیق اثر گذار باشد. همچنین ممکن است نوع تغذیه یا ابتلا به بیماریهای خاص و داروهایی که به طور زمینه ایی در بیماران مصرف شده، عاملی برای این تفاوت ها در جمعیت های مختلف مردان باشد که به این موارد پرداخته شده است.
برای ژن TNP2 در NCBI چندین پلیمورفیسم ثبت شده است. ازجمله این پلیمورفیسمها میتوان به T76G, G117C, C301T, C391T, C78T اشاره نمود که توسط ایمکن و همکارانش در سال 2009 در 135 مرد نابارور موروکایی و فرانسوی بررسی شدند و نتایج آنان نشان داد که تفاوت معنیداری با گروه کنترل نداشتند [9]. همچنین دو پلیمورفیسم T1019G و G1272C در جمعیت 282 مرد نابارور ژاپنی بررسی شدند و در نتایج مطالعات انجام گرفته، تفاوت معنیداری با گروه مردان بارورگزارش نشد [15]. در پلی مورفیسم های دسته دیگری از ژن های پروتامینی TP که ژن TNP1 است نیز مطالعاتی صورت گرفته است که مطالعه حیدری و همکارانش در سال 2014 روی 82 مرد نابارور ایرانی نشان داد در 15 مورد پلی مورفیسم T75C در گروه مردان نابارور مشاهده شد در حالیکه در هیچ یک از 80 مرد نرمال گزارش نشد و در نتیجه امکان تاثیر آن بر روند ناباروری مطرح گردید ]6[.
در این تحقیق نیز که به بررسی ارتباط بین چهار پلیمورفیسم در ژن پروتامینی TNP2 با ناباروری مردان ایرانی انجام گرفته است نتایج نشان داد که ارتباط معنیداری بین حضور پلیمورفیسم G1272Cدر ژن TNP2(P=0. 6) با ناباروری مردان وجود ندارد. همچنین پلیمورفیسم T1019Gو دو جهش حذفیG deletion at nt 1036 and 1046درژنTNP2 در هیچ یک از نمونههای مردان نابارورو بارورایرانی یافت نشد و چنین گزارش شد که بین حضور آنها در جمعیت مردان نابارور ایرانی و ایجاد اولیگواسپرمی و آزواسپرمی ارتباطی وجود ندارد.
مطالعات اخیر نشان داده است که ژنهای پروتامین بصورت کلاستر میباشند و بطور اختصاصی در روند اسپرماتوژنز(در تشکیل اسپرم بالغ) درپستانداران نقش دارند، به طوری که تغییرات کوچک در آن ها میتواند اثرات مهمی در تغییر بیان یا تغییر رونویسی و ترجمه این ژنها در پروسه اسپرماتوژنز دارا باشد [ 5 ، 8 و 23]. بنابراین چنین نتیجه گیری می شود که ژنهای پروتامین، ژنهایی اختصاصی و با ساختمان ثابت هستند که برای روند اسپرماتوژنز نرمال ضروریاند و حضور پلیمورفیسم و جهشها در این ژن ها میتواند سبب ناباروری مردان گردد. گرچه با توجه به این تحقیق و مطالعات گذشته این اثرات به ندرت سبب ایجاد ناباروری میشود ولی حضور این پلیمورفیسمها و همچنین تغییرات اپی ژنتیک که در روند تغییرات پس از ترجمه این ژن ها اعمال می گردد می توانند به عنوان عاملی در تخریب روند اسپرماتوژنز مطرح باشند. همچنین با توجه به دامنه وسیع مطالعات در سال های اخیر و گستردگی مباحث مورد بحث در زمینههای ناباروری و تخصصی شدن هر یک از شاخههای مربوط به این دانش، لازم است تحقیقاتها با روش های جدید و شیوههای نوین در بررسی جهشها و پلیمورفیسم ها انجام پذیرد. همچنین برای برآورد نتایج دقیقتر و کامل تر شدن آن ها به بررسی در جمعیت های مختلف و هاپلو تایپ های متفاوت پرداخته شود. با توجه به این مسئله که روز به روز بر تعداد این جهشها و پلیمورفیسمهای جدید مرتبط با ناباروری افزوده میشود و تکنیکهایهایHigh through put و مدرن نیز در این رشته درحال افزایش است لزوم به کارگیری این متدها در این زمینه ضروری است، خصوصا در بررسیهایی که به بررسی تعداد زیاد نمونه پرداخته میشود. بعنوان مثال روش HRM-RT PCRیا Size Fragmentation Analysis و یا روشهایی که از microRNA ها استفاده میشود و با Real Time PCR نتایج بررسی میشود میتواند راهگشایی برای مطالعات جامعتر و مثمر ثمرتری برای آینده باشد. خصوصا در زمینه درمان و فارماکولوژی این مطالعات میتوانند مکملی بر کارهای گذشتگان باشد.