بررسی ترمیم و مطالعه کاریوتایپ در پلاناریای گونه Schmidtea mediterranea

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

چکیده

از دیرباز توانایی ترمیم نامحدود بافت های از دست رفته در نتیجه پبری و آسیب مورد توجه و بررسی بوده است. بیش از 250 سال است که پلاناریا به دلیل داشتن توانایی خارق‌العاده‌ درترمیم و بازسازی اندام‌ها و بافت‌های ازدست‌رفته به‌وسیله یک جمعیت از سلول‌های بنیادی پرتوان به نام نئوبلاست‌ مورد توجه می­باشد. از ویژگی‌های کلیدی نئوبلاست‌ها داشتن ظرفیت نامحدود برای خود تجدیدی، قدرت پرتوانی و توانایی سلول‌های حاصل برای تفسیر پیام‌های تمایزی است تا بتواند پاسخ صحیحی در جایگزین کردن ساختارهای ازدست‌رفته ایجاد کند. در این مطالعه، بررسی روند ترمیمی و تعداد کروموزومی در پلاناریا در گونه مدیترانیا موردبررسی قرار می‌گیرد. در این تحقیق، بعد از یک هفته گرسنگی، پلاناریا‌ها به قطعات سری، تنه‌ای و دمی تقسیم‌شدند و در ظروف 6 خانه‌ای حاوی 1 میلی‌لیتر محیط اختصاصی پلاناریا قرارگرفتند و به مدت دو هفته موردبررسی و مطالعه قرار گرفتند. با توجه به این‌که دو نوع ترمیم اپی‌مورفوزیس و مورفولاکسیس در پلاناریا در طول 14 روز رخ می‌دهد، تمام‌اندام‌ها و بافت‌ها به‌طور کامل جایگزین و بازسازی شدند.در مرحله بعد با استفاده از دستورالعملکاریوتایپ که در پژوهشگاه رویان بر اساس این تحقیق انجام شده است، 8 جفت کروموزوم در این گونهشناسایی شد. پلاناریا به دلیل داشتن سلول‌های بنیادی پرتوان می‌تواند در طول‌ترمیم ساختارهای ازدست‌رفته به دلیل قطع و یا آسیب‌های بافتی را بازسازی کند. این روند ترمیمی که حاصل از تمایز سلول‌های اولیه و تمایزیافته است، می‌تواند پیش‌نیاز کارهای آینده در درمان انواعی از بیماری‌ها در چشم‌انداز پزشکی ترمیمی باشد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Study the regeneration and analyze the karyotype of the planarian Schmidtea mediterranea

چکیده [English]

Having an unlimited capacity to regenerate tissues lost to age and injury has been studied and analyzed. Planarians are attended for more than 250 due to their ability of complex regenerative achievements dependent on a population of self-renewing adult stem cells called neoblasts. The key attribute of neoblasts are their capacity for imprecise self-renewal, their pluriputency and the ability of their progeny to explain differentiation and polarity signals and correctly replace lost organelsand tissues after damage. In this study, we explored the regeneration in planarian species of Schmidtea mediterranea. Here, study and analysis all planarians which are cut into 3 fragments including head, trunk, and tail regions after 1 week of starvation, put in 1ml PAM in 6 well-plates during two weeks. As regards, there are epimorphosis and morpholaxis regeneration in 14 days of planarian regeneration, all tissues and organs will completely repair and regenerate after injured. In the next step, the karyotype protocol which has set up in this research has shown 8 pairs of chromosomes in this species. Planarians because of having pluripotent stem cells will regenerate lost tissues and cells and during regeneration. Given that process the differentiation and undifferentiated stem cells is a prerequisite for the future therapy.

کلیدواژه‌ها [English]

  • karyotype
  • Neoblast
  • Planaria
  • regeneration
  • Schmidtea mediterranea

امروزه پزشکی ترمیمی از اهمیت بسیار زیادی برخوردار است به همین جهت تحقیقات گسترده‌ای به‌منظور دست‌کاری سلول‌های بنیادی و استفاده آن‌ها در آسیب‌های بافتی و درمان بیماری‌های انسانی از قبیل بیماری‌های قلبی، عصبی، استخوانیو غضروفی انجام می‌شود. هرچند که درک کافی درباره مکانیسم ترمیم و عدم وجودترمیم در موجودات مختلف به‌طور کامل مشخص نشده است، در شاخه متازوآ گونه‌هایمختلفی وجود دارند که توانایی ترمیمی متفاوتی نسبت

به هم دارند[2].

در میانموجوداتی که دارای تقارن دو طرفی هستند، پلاناریا‌ها جز قدرتمندترین موجودات از لحاظ ترمیم به‌حسابمی‌آیند. در پلاناریا انواع سلول‌ها توسط یک جمعیت از سلول‌های بنیادی پرتوان بالغ به نام نئوبلاست‌ها جایگزین می‌شوند[27، 14، 4].این اصطلاح را هریت راندولف در سال 1892 به سلول‌های مشابه جنینی تمایز نیافته که در طول شکل‌گیری مزودرم جدید پس از شکافت در کرم‌های خاکی ایجاد می‌شود، اشاره‌کرده است[24]. پلاناریاها اعضای آزاد زیر راسته Seriata از رده Turbellaria از همین شاخه هستند [29]و نام عمومی اعمال‌شده به گونه‌ای از راسته Tricladida و از شاخه کرم‌های پهناست[12]. پلاناریا دارای سه لایه جنینی و فاقد حفره است. در طبیعت تولیدمثل آن‌ها به دو ‌صورت جنسی و غیرجنسی است[7]. این موجودات فاقد گردش خون، سیستم تنفسی و ساختار اسکلتی هستند و یک توده محکم از بافت، به نام مزانشیم یا پارانشیم، فضای بین اپیدرم و رودهرا پرکرده است[27]. بدن آن‌ها دارای سیستم گوارشی، دفعی، مغز، سیستم پاسخ به نور، سیستم عصبی و یک حلق است. نئوبلاست‌ها 30-20٪بدنیککرمبالغراتشکیل می‌دهند که به‌عنوان تنها سلول‌های تکثیر شونده در بدن تعریف‌شده‌اند.توزیع این سلول‌‌ها در طول مزانشیم صورت گرفته است و در ناحیه حلق و مناطق مقابل گیرنده سری وجود ندارند[3, 17]. تولید سلول‌های جدید و جایگزینی آن‌ها با سلول‌های ازدست‌رفته و یا قدیمی می‌تواندمقابله با شرایط نامناسب و بی‌غذایی را برای رشد و یا عدم رشد و حفظ هوموستازی فراهم کند [22, 30].

ترمیم مستلزم دریافت پیام درنتیجه از دست دادن

اندام‌ها و ساختارهای پیچیده است که تکثیر و تمایز سلول‌های جدید، ساخت مجدد بخش‌های ازدست‌رفته را القاء می‌کند، و سپس پیام‌ها و دستور العمل‌های خاص، الگو‌های مناسب در بازسازی اندام‌ها و بافت‌های جدید را فراهم می‌کند. در آخر، بافت‌ها، اندام‌ها و ساختار‌های جدید باید با بافت‌های قبلی در بازگرداندن عملکرد طبیعیهم مسیر می‌شوند[13].بازسازی در پلاناریا به دو نوع ترمیم اپی‌مورفوزیس ومورفولاکسیس تقسیم می‌شوند[20]. درترمیم اپی‌مورفوزیس تکثیر سلول از تکوین بخش جدید پیشی می‌گیرد و پدیده تشکیل بلاستما-جوانه فاقد رنگ‌دانه با منشأ مزانشیمی- درترمیم رخ می‌دهد. درترمیم مورفولاکسیس بخشی از اندام به طور مستقیم به اندام جدید و یا بخشی از اندام جدید تغییر شکل می‌دهد و این عمل بدون تکثیر سلولی در سطح بریدگی اتفاق می‌افتد[5].

در بررسی ترمیمبه نظر می‌رسد که محرک بازسازی در پلاناریا ایجادآسیب است و قطع عضو موجب یک سری از پاسخ‌ها می‌شود که هدف آن‌ها به حداقل رساندن از دست دادن بافت‌ها است . در ابتدا، بخش آسیب‌دیده پلاناریا نسبت به زخم عکس‌العمل نشان می‌دهد و انقباض ماهیچه‌ای قوی در محل زخم در عرض چند ثانیه رخ می‌دهد تا جایی که مساحت سطح به حداقل می‌رسد[20]. سپس، سلول‌های رابدیتبه‌عنوان سلول‌های حفاظتی در محل زخم با ترشح مخاط یک پوشش ایجاد می‌کنند[26]. فرآیند انتشار سلولی به‌جای تکثیر سلولی، لایه‌نازک اپیتلیوم زخم را در مدت 30 دقیقه می‌پوشاند. زمانی که فعالیت میتوزی در پلاناریای دارای بریدگی بررسی می‌شود، تکثیری ناگهانی و وسیع سلول‌ها در نزدیکی مکان آسیب مشاهده می‌شود که منجر به تولید یک جوانه بدون رنگ در اثر برهمکنش سلول‌های پوششی با مزانشیم زیرین خود می‌شود و از آن تحت عنوان بلاستمای ترمیم نام برده می‌شود [19]. برخلاف بافت اسکار که در انسان ایجاد می‌شود، در پلاناریا بلاستما تشکیل می‌شود. بنابراین در پلاناریا در مکان بریدگی، بافت پوششی در تماس مستقیم با بافت‌های دیگر است[4]. در آخرین مرحله از بازسازی پلاناریا درنتیجه تمایز سلول‌های ترمیمی در پاسخ به نور عکس‌العمل دارد که نشان دهنده کامل شدن ترمیم است[6]. پلاناریا یک مدل ترمیمی بسیار قوی در شرایط In vivo است، در این تحقیق بررسی کاریوتایپ صورت گرفته است به دلیل استفاده از بلاستما، ناحیه بی رنگ که حاصل از روند ترمیمی بوده و مملو از سلول‌های در حال تقسیم میتوزی در این مدل دستورالعمل کاریوتایپ بررسی و انجام شد به علت اینکه پروتکل جامعی را برای گونه های دیگر ارائه دهیم. به همین دلیل در اینجا روند ترمیمی در ناحیه آسیب دیده و کاریوتایپ گونه غیرجنسی پلاناریای مدیترانیا موردبررسی قرارگرفته است.

 

مواد و روش‌ها

شرایط نگهداری پلاناریا

در این تحقیق از پلاناریای غیرجنسی کلون شده گونه Schmidtea mediterranea که در پژوهشگاه رویان نگهداری می‌شود، استفاده‌شده است. به‌منظور نگهداری پلاناریا از محیط اختصاصی[1](PAM) با 2/7-8/6 pH=استفاده شد که در دمای 2۰-16 درجه سانتی‌گرادو در تاریکی درون ظروف شیشه‌اییا پلاستیکی نگهداری می‌شود. برای تغذیه پلاناریاها از کبد گوساله استفاده شد. کبد را به قطعات کوچک 2 سانتی‌متری تقسیم نموده، در ظروف ریخته و بعد از سه ساعت باقیمانده کبد را از محیط خارج و پلاناریاها به ظروف جدید با محیط اختصاصی تازه منتقل شدند.

 

جدول1. ترکیب شیمیایی محیط اختصاصی پلاناریا

ردیف

نام ماده

غلظت موردنیاز
(میلی مولار/1 لیتر)

1

سدیم کلرید

6/1

2

کلسیم کلرید

0/1

3

منیزیم سولفات

0/1

4

منیزیم کلرید

1/0

5

پتاسیم کلرید

1/0

6

سدیم بیکربنات

2/1

 

قطعه‌قطعه کردن پلاناریا

برای قطعه‌قطعه کردن پلاناریاها در شرایط آزمایشگاهی، به مدت یک هفته به پلاناریاها غذا داده نمی‌شد و سپس با استفاده از تیغ جراحی در پتری دیش‌های شیشه‌ای بزرگ آن‌ها به 3 یا 5 قطعه تقسیم می‌شدند.

 

بررسی روند ترمیمی

بعد از یک هفته شرایط گرسنگی، بدن 5 عدد پلاناریا به سه قطعه سر، تنه و دم تقسیم شدند. قطعات در ظروف 6 خانه‌ای قرار داده شدند که هر چاهک حاوی 5 میلی‌لیتر از محیط اختصاصیPAM بود. سه قطعه بدن پلاناریا به مدت 14 روز بررسی شدند و در طی این مدت تحت عکس‌برداری و فیلم‌برداری قرار گرفتند (شکل1).

 

بررسی کاریوتایپ

برای انجام کاریوتایپ (شکل2)، پلاناریا‌ها بعد از

یک هفته گرسنگی به قطعات بسیار کوچک تقسیم شدند. قطعات پلاناریا در ظروف 6 خانه‌ای در یک میلی‌لیتر محیط به همراه 200 ماکرو لیتر کلشی سین به مدت 16-20 ساعت در دمای 22 قرار گرفتند. سپس این کرم‌های پهن به مدت 1 تا 2 ساعت در محلول هایپو (آب دو بار تقطیر) در دمای اتاق قرار داده شدند (بعد از این مرحله ترجیحاً منطقه بلاستما جدا می‌‌شد). با استفاده از محلول Carnoy (اتانول 100% و استیک اسید 100% به نسبت 3 به 1) در دمای 20- به مدت 20 دقیقه نمونه‌ها فیکس شدند. پلاناریاها به مدت 15 دقیقه در استیک اسید 45% قرار داده شدند. در مرحله لام گیری از روش لام گرم استفاده شد و نمونه‌ها را بین لام و لامل له کرده تا یک‌لایه بسیار نازک از سلول‌ها بر روی لام قرار گیرد. بعد از جدا کردن لامل‌ها، لام‌ها با استون شستشو داده شدند. در آخر رنگ‌آمیزی لام‌ها با رنگ گیمسا انجام شد.

 

 

شکل 1. شکل شماتیک از روش بررسی روند ترمیم پلاناریا. پلاناریا را بعد از یک هفته گرسنگی قطعه قطعه کرده و در ظروف شش خانه ای قرار داده و به مدت 14 روز روند ترمیمی را مورد بررسی قرار داده ایم.

 

 

شکل2. شماتیک مراحل انجام دستورالعمل کاریوتایپ. 1. قطعه قطعه کردن 2.کلشیسین 3.محلول هایپو 4.جدا کردن بلاستما 5.محلول Carnoy 6. استیک اسید 45% 7و8.لام گرم 9.رنگ آمیزی با گیمسا 10.بررسی

 


نتایج:

-       ارزیابی روندترمیم

با توجه به اینکه نمونه‌ها به سه قسمت سر، تنه و دم تقسیم شده بودند به‌صورت جداگانه در چاهک‌هاقرار داده شدند و در طی 14 روز بررسی شدند که مورفولوژی آن‌‌ها در روزهای 3، 5، 7، 10 و 14 در شکل‌ آورده شده‌ است (شکل5 و 4، 3). به‌محض ایجاد برش، تقسیم میتوزی در سلول‌های این ناحیه منجر به بسته شدن زخم و تشکیل بلاستما در 30 دقیقه اول می‌شود. ناحیه ازدست‌رفته در 7 روز اول تحت ترمیم اپی‌مورفوزیز ترمیم می‌شود که با تشکیل بلاستما همراه بوده و روند تکثیر و رشد سلولی به‌طور کامل انجام می‌شود[20]. از روز هفتم تا چهاردهم ترمیم از نوع مورفولاکسیس است که در این حالت تکثیر سلولی وجود ندارد بلکه با ایجاد تناسب بین اعضا جدید و قدیم پلاناریا به شکل کامل یک پلاناریا بالغ دست می‌یابد[5].

 

روند ترمیم در سر:

در این ناحیه بخش اعظم سیستم عصبی مرکزی ازجمله گانگلیون‌های مغزی، چشم‌ها و سیستم عصبی محیطی و ماهیچه‌ها وجود دارند. در بخش سری فقط حلق به‌صورت کامل وجود ندارد. در این ناحیه بعد از شکل‌گیری بلاستما در روز ۳ ادامه سیستم عصبی محیطی و ماهیچه‌ها شکل می‌گیرند و از روز پنجم به بعد حلق شروع به شکل‌گیری می‌کند (شکل3).

 

روند ترمیم در تنه:

در قسمت جلویی بخش تنه که ناحیه سری ایجاد می‌شود انتظار می‌رود گانگلیون‌های مغزی، چشم‌ها و ادامه سیستم عصبی و در قسمت عقبی که ناحیه دمی ایجاد می‌شود انتظار می‌رود ادامه سیستم عصبی و ماهیچه‌ها در طی ترمیم تشکیل ‌شود. در ناحیه تنه، حلق به‌طور کامل وجود دارد. در قسمت جلویی تنه، چشم‌ها از روز چهارم 6 تشکیل می‌شوند (شکل4).

 

 

شکل3. روند ترمیم در قطعه سری پلاناریا. شکل‌گیری حلق در روز 5، 7 و 10 قابل مشاهده است. از روز 10 به بعد حلق کاملاًتشکیل‌شده است.

 

 

شکل4. روند ترمیم در قطعه تنه ای در پلاناریا. شکل‌گیری چشم‌ها در روز 5، 7 قابل مشاهده می باشد و از روز 10 به بعد به صورت کامل تشکیل شده و مشخص است.

 


روند ترمیم در دم:

در این ناحیه بخش اعظم سیستم عصبی مرکزی ازجمله گانگلیون‌های مغزی، چشم‌ها و سیستم عصبی محیطی و ماهیچه‌ها و حلق وجود ندارد. از روز 4 چشم‌ها و روز 5 حلق در طی ترمیم قابل‌مشاهده هستند (شکل5).

-       کاریوتایپ

بررسی متافاز بر روی لام ها بر اساس روش له کردن بر روی لام گرم در گونه غیرجنسی پلاناریا نشان می­دهد این گونه دارای 8 جفت کروموزوم می­باشد. سلول­های در حال تقسیم در ناحیه بلاستمای ایجاد شده پس از قطعه قطعه کردن و آسیب بافتی در این تحقیق مورد استفاده قرارگرفته است که نشان دهنده قدرت ترمیمی بسیار بالا است. در اینجا بررسی تعداد کروموزومی بر اساس
سلول­هایی با قابلیت تقسیم و ترمیم مورد بررسی قرار گرفته است. شکل 6 نشان دهنده تعداد کروموزوم‌ها و نحوه قرارگیری در گروه‌های مربوطه بر‌اساس اندازه می باشد [20]. 

 

 

شکل5. روند ترمیم در قطعه دمی در پلاناریا. شکل‌گیری چشم‌ها در روز 5، 7 قابل مشاهده می­باشد و از روز 10 به بعد به صورت کامل تشکیل شده و مشخص است.

 

شکل6. کروموزوم‌ها در گونه مدیترانیا .الف) تمای کلی از کروموزوم ها در گونه مدیترانیاکه دارای 8 جفت کروموزوم(8=n2) است. ب) فلش‌ها نشان‌دهنده ناحیه جابجا‌شدگی در گونه غیرجنسی پلاناریا گونه مدیترانیا می‌باشند.

 

 

بحث و نتیجه گیری:

بازسازی یک پدیده گسترده در سراسر قلمرو حیوانات است، اما تغییرات آن از بی‌مهرگان تا انسان کاملاً متفاوت بوده است. در میان بی‌مهرگان پلاناریا به دلیل داشتن سلول‌های بنیادی پرتوان، پتانسیل‌ترمیمخارق‌العاده و ژن‌های مشترک با مهره‌داران ازجمله انسان مشابه می‌باشد به همین دلیل موردتوجه ویژه و روزافزون محققین قرار گرفته است[15]. بیش از 250 سال است که توانایی‌ترمیم در پلاناریا موردبررسی قرارگرفته است و پالاس اولین بار در قرن 18، توانایی‌ترمیم یک قطعه بریده‌شدهسری را در یک پلاناریای کامل توضیح داد[20]. پلاناریا می‌تواند به‌عنوان مدلی مناسب جهت مطالعه رفتار سلول‌های بنیادی بالغ در حالت In vivo مورداستفاده قرار گیرد[16].

ژنوم پلاناریا گونه Schmidtea mediterranea به‌طور کامل توالی­یابی شده است و امکان مطالعات مولکولی و ژنتیکی را فراهم می‌سازد[11]. مکانیسم‌های مولکولی تنظیم‌کننده پرتوانی در پلاناریا، سلول‌های بنیادی جنینی و زاینده پستانداران در طول تکامل کاملاً حفظ‌شده و مشترک می‌باشنددرنتیجه پلاناریا می‌تواند مدل مناسبی جهت مطالعات سلول‌های بنیادی انسانی مورداستفاده قرار گیرد[20, 22, 21].بسیاری از پروتئین‌های پلاناریا مشابه پروتئین‌های انسانی هستند و بسیاری از ژن‌های پلاناریا شناخته‌شده‌اند که با بیماری‌های انسان مرتبط هستند [16]. به عنوان مثال باوجود درجه نسبتاً بالای حفاظت‌شدگی بین پروتئین‌های عصبی در پلاناریا و مهره‌داران، پژوهشدر مورد پلاناریا می‌تواند منتج به فعال نمودن ترمیم شبکه‌های عصبی پستانداران گردد که توانایی‌ترمیم بسیار محدودی دارند [21, 18]. امید بر آن است با استفاده از این شباهت‌ها در ژن‌ها و پروتئین‌ها در آینده‌ای نه چندان دور راه‌حل مناسبی جهت درمان بیماری‌ها ارائه شود. تکنیک‌های مختلفی ازجملهRNAi، فن Brdu، ایجادتداخل ژنی باواسطهRNA دو رشته‌ای و هیبریداسیون درجا برای مطالعه عملکرد ژنی در پلاناریا‌ وجود دارد [28].

با توجه به این‌که صدها گونه ازپلاناریاها وجود دارند، انتخاب هرگونه تنها به‌عنوان یک مدل برای تجزیه‌وتحلیل تکنیک‌های مولکولی با مشکلات زیادی همراه است. در حالت ایده آل، انتخاب یک‌گونه بر اساس چند ویژگی ازجمله سهولت نسبی پرورش در آزمایشگاه، رشد و نمو (وجود انواع جنسی و غیرجنسی)، ژنوم دیپلوئید و اندازه کوچک، قابل‌مقایسه است. بیشتر گونه‌های شناسایی‌شدهدر پلاناریا‌ به‌عنوانمیکسوپلوئیدو یا پلیپلوئید معرفی و بررسی‌شده‌اند[26]. برای مثال، بررسی و مطالعه ژن‌ Hoxبه دلیل اینکه در گونه‌هایGirardiatigrina (16=n2) [10]وDugesia japonica(24=n3) [9]به‌صورت میکسوپلوئیدی هستند، مختل شده است. برخلاف گونه‌های فوق، مدیترانیا یک دیپلوئید پایدار(8=n2) با یک ژنوم هاپلوئید 108x7 ~ است [8, 12]. به دلیل همین ثبات است که این‌گونه مدل جهانی شده است.

با توجه به قوی بودن ترمیم در این‌گونهتمایز نئوبلاست‌هاوتشکیلبلاستمادرپلاناریابه‌عنوانیکمدل In vivo موردتوجهقرارگرفتهاست [4]. به همین دلیل با استفاده از سلول‌های در حال تقسیم، فاز متافازی کروموزوم‌ها در این‌گونهبررسی‌شده است. روش­های متفاوتی برای بررسی کاریوتایپ در
گونه­های مختلف انجام شده است که این روش نیز در پژوهشگاه رویان بر اساس تحقیق انجام شده بر روی گونه Scmidtea mediterranea بررسی شده است. بررسی این‌گونه از پلاناریا شرایط لارم برای بررسی روند ترمیمی و بررسی کروموزومی در گونه‌های دیگری از پلاناریا را برای ما فراهم می‌کند. امید می‌رود با استفاده از روش‌های انجام‌شده در این تحقیق، شرایط لازم را برای معرفی گونه‌های جدید و مقایسه آن‌ها با گونه مدیترانیا نیز فراهم کند.

 

[1]      Aboobaker, A. A. and D. Kao (2012). "A lack of commitment for over 500 million years: conserved animal stem cell pluripotency." The EMBO journal31(12): 2747-2749.

[2]      Agata, K. (2003). "Regeneration and gene regulation in planarians." Current opinion in genetics & development13(5): 492-496.

[3]      Agata, K., T. Tanaka, C. Kobayashi, K. Kato and Y. Saitoh (2003). "Intercalary regeneration in planarians." Developmental dynamics226(2): 308-316.

[4]      Alvarado, A. S. (2004). "Planarians." Current Biology14(18): R737-R738.

[5]      Alvarado, A. S., P. A. Newmark, S. M. Robb and R. Juste (2002). "The Schmidtea mediterranea database as a molecular resource for studying platyhelminthes, stem cells and regeneration." Development129(24): 5659-5665.

[6]      Alvarado, A. S. and P. A. Tsonis (2006). "Bridging the regeneration gap: genetic insights from diverse animal models." Nature Reviews Genetics7(11): 873-884.

[7]      Baguñà, J. (2012). "The planarian neoblast: the rambling history of its origin and some current black boxes." International Journal of Developmental Biology56(1-2-3): 19-37.

[8]      Baguñà, J., S. Carranza, M. Pala, C. Ribera, G. Giribet, M. A. Arnedo, M. Ribas and M. Riutort (1999). "From morphology and karyology to molecules. New methods for taxonomical identification of asexual populations of freshwater planarians. A tribute to Professor Mario Benazzi."

[9]      Bayascas, J., E. Castillo, A. Munoz-Marmol and E. Salo (1997). "Planarian Hox genes: novel patterns of expression during regeneration." Development124(1): 141-148.

[10]  Benazzi, M. and G. Benazzi-Lentati (1976). "Animal Cytogenetics, vol. 1." Platyhelminthes. Gebr. Borntraeger, Berlin and Stuttgart.

[11]  Cantarel, B. L., I. Korf, S. M. Robb, G. Parra, E. Ross, B. Moore, C. Holt, A. S. Alvarado and M. Yandell (2008). "MAKER: an easy-to-use annotation pipeline designed for emerging model organism genomes." Genome research18(1): 188-196.

[12]  Carranza, S., J. Baguna and M. Riutort (1997). "Are the Platyhelminthes a monophyletic primitive group? An assessment using 18S rDNA sequences." Molecular Biology and Evolution14(5): 485-497.

[13]  Cebrià, F., T. Adell and E. Saló (2010). "Regenerative medicine: lessons from planarians." Stem cell, regenerative medicine and cancer. Nova Science Publisher, Hauppauge, NY: 29-68.

[14]  Forsthoefel, D. J. and P. A. Newmark (2009). "Emerging patterns in planarian regeneration." Current opinion in genetics & development19(4): 412-420.

[15]  Forsthoefel, D. J., A. E. Park and P. A. Newmark (2011). "Stem cell-based growth, regeneration, and remodeling of the planarian intestine." Developmental biology356(2): 445-459.

[16]  Gentile, L., F. Cebrià and K. Bartscherer (2011). "The planarian flatworm: an in vivo model for stem cell biology and nervous system regeneration." Disease Models and Mechanisms4(1): 12-19.

[17]  Handberg-Thorsager, M., E. Fernández and E. Salo (2008). "1. Abstract 2. Stem cells and regeneration 2.1. Stem cells 2.2. Regeneration across the animal kingdom 2.3. Making use of regeneration 3. Planaria, a real regenerating model system 3.1. Historical overview." Frontiers in Bioscience13: 6374-6394.

[18]  Mineta, K., M. Nakazawa, F. Cebrià, K. Ikeo, K. Agata and T. Gojobori (2003). "Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs." Proceedings of the National Academy of Sciences100(13): 7666-7671.

[19]  Newmark, P. A. and A. S. Alvarado (2001). Regeneration in planaria, Wiley Online Library.

[20]  Newmark, P. A. and A. S. Alvarado (2002). "Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics." Nature Reviews Genetics3(3): 210-219.

[21]  Önal, P., D. Grün, C. Adamidi, A. Rybak, J. Solana, G. Mastrobuoni, Y. Wang, H. P. Rahn, W. Chen and S. Kempa (2012). "Gene expression of pluripotency determinants is conserved between mammalian and planarian stem cells." The EMBO journal31(12): 2755-2769.

[22]  Oviedo, N. J., P. A. Newmark and A. Sánchez Alvarado (2003). "Allometric scaling and proportion regulation in the freshwater planarian Schmidtea mediterranea." Developmental dynamics226(2): 326-333.

 

[23]  PRATS, J. (1991). "Analisi del contingut de DNA a planaria d'aigües dolces per citometria de flux i citoespectrofotmetria." Universitat de Barcelona.

[24]  Randolph, H. (1892). "The regeneration of the tail in Lumbriculus." Journal of Morphology7(3): 317-344.

[25]  Reddien, P. W. and A. S. Alvarado (2004). "Fundamentals of planarian regeneration." Annu. Rev. Cell Dev. Biol.20: 725-757.

[26]  Reisinger, E. and S. Kelbetz (1964). "[FINE STRUCTURE AND DISCHARGE MECHANISM OF RHABDITES.]." Zeitschrift fur wissenschaftliche Mikroskopie und mikroskopische Technik65: 472-508.

[27]  Saló, E. (2006). "The power of regeneration and the stem‐cell kingdom: freshwater planarians (Platyhelminthes)." Bioessays28(5): 546-559.

[28]  Saló, E. and J. Baguna (2002). "Regeneration in planarians and other worms: new findings, new tools, and new perspectives." Journal of Experimental Zoology292(6): 528-539.

[29]  Sluys, R., M. Kawakatsu, M. Riutort and J. Baguna (2009). "A new higher classification of planarian flatworms (Platyhelminthes, Tricladida)." Journal of Natural History43(29-30): 1763-1777.

[30]  Takeda, H., K. Nishimura and K. Agata (2009). "Planarians maintain a constant ratio of different cell types during changes in body size by using the stem cell system." Zoological science26(12): 805-813.