مطالعاتگردهشناختیجایگاهویژهایدرعلمگیاهشناسی دارد. از آنجایی که دانههای گرده به عنوان یک عامل حساسیتزا برای انسانها مطرح هستندو بررسی آنها در زمینه آلرژیزایی اهمیت ویژهای دارد. در مطالعات مربوط به آلرژی دانههای گرده، درختان، علف هرز و چمنها به عنوان عامل موثر در افزایش حساسیتزایی فصلی مطرح هستند. از جمله درختانی که دارای گردههای باد دوست بوده و بسیار مورد توجه متخصصان آلرژی است، درخت بلوط استکه در نقاط مختلف کشور به صورت خودرو میروید.کسب آگاهیهای علمی در مورد مراحل تکوینی دانه گرده گیاه بلوط و آلرژیزایی آن هدف پژوهش حاضر است. دانههای گرده از نقاط مختلف استان ایلام جمعآوری شدند و بررسیهای سلول-بافت‌شناسی برای آنها انجام شد. به منظور مشاهده اگزین دانه گرده از روش استولیز استفاده شد. آزمونهای سنجش ابتدایی برایتشخیص آلرژی روی رتهای نر با وزن متوسط 200 گرم انجام گرفت.عصاره گردهای پنج درصد با استفاده از بافر فسفات نمکی در pH: 7/ 4 تهیه شد. از رتهای مورد آزمایش پس از2، 8 و 24 ساعت و یک هفته از آخرین تزریق میزان IgE تام خون انجام شد. تشکیل ویل وفلر به وسیله آزمونهای پوستی نتایج مثبت را در حد منحنی P≤0.05 نسبت به نمونه کنترل نشان داد.با توجه به نتایج به دست آمده،عصاره گردهای بلوطآلرژیزایی از نوع تیپ یک آلرژی را نشان میدهد.
تیره راش(Fagaceae)با داشتنحدود900 گونه درختی و درختچهای خزانکننده و همیشه سبز یکی از تیره‌های متنوع گیاهی محسوب میشود و پراکنش وسیعی در نیمکره شمالی دارد. این تیره دارای سه زیر تیره و ده جنس است که بلوط با 300 ]18 [تا 600 ]20 [ گونه بزرگترین جنس این خانواده را تشکیل میدهد]16[. بلوط ایرانی با نام علمیQuercusbrantiiگیاهی پایا باگلآذین دمگربه ای نر،پرچم‌ها 7-5 تائی، گلهای ماده منفرد یا دوتائی میباشد وگرده افشانی آن به وسیله باد است]11[.بلوط از جمله درختان خودروی قسمتهای مختلف ایران و بخصوص مناطق زاگرس به ویژه استانهای غرب کشور میباشد. در استان ایلام جنگل های بلوط به دلیل موقعیت، عملکرد و تنوع زیستی حاکم بر آن از اهمیت ویژهای برخوردار است.گذشته از نقش حیاتی، این درخت بسیار زیبا در حفظ استحکام منطقه از نظر سیلاب در پاکیزگی هوا و در تشکیل پوشش جنگلی منطقه مورد توجه میباشد]3[.گزارشهای متعددی در زمینههای اکولوژیکی گیاه در مناطق مختلف ایران توسط احمد حسینی و همکاران انجام شده است]10[. همچنین مطالعاتی در زمینه ضد میکروبی میوه آن]4 [و پژوهشهای هم در زمینه تاثیرات فیزیولوژیکی ]2 [و محیطی]1 [ توسط شیوا صفرپور و همکاران انجام شده ،اما تاکنون بررسیهای آلرژی زایی دانههای گرده گیاه بلوط در کشور ما نتایجی ارائه نشده است.گزارش‌ها در ارتباط با بیماری‌های رینیت و آسم آلرژیک در ارتباط با قرار گرفتن در معرض دانههای گرده حال افزایش است]7و8[.در پژوهش حاضر سعی شده، پس از بررسیهای میکروسکپی دانه های گرده گیاه و سنجش ابتدایی تشخیص آلرژیهای گرده به کمک آزمونهای پوستی میزان تام IgE به طور تجربی بررسی شود.
مواد و روشها
جمعآوری گردهها
گل آذینهای نر درخت Q.brantiiدر اوایل فروردین ماه سال 1391 و 1392 از نقاط مختلف استان ایلام جمع آوری و بساکهای رسیده آن از گل‌ها جدا و دانههای گرده با خرد کردن بساک و غربال نمودن به کمک غربال 70 میکرون جداسازی و در 0C 20- نگهداری شدند]5و9 [.
بررسی میکروسکوپی بساک و دانه های گرده
گلهادرمراحلمختلف نمویجهت مطالعات
بافت-سلول شناختیتثبیت کننده(Formalin Acetic acid Ethanol)FAA70%قراردادهشدند. سپسذخیره‌سازیدرالکل70 درصدانجام شد. پسازجاسازی،برش‌گیرینمونه‌هادرقالب‌هایپارافینبامیکروتومدراندازه10میکرو متر صورت گرفت]21 [واز روشرنگ‌آمیزیمضاعفهستهوسیتوپلاسمبه‌وسیله هماتوکسیلینوائوزیناستفاده شد.نمونه‌هایموردمطالعهبامیکروسکوپنوری مشاهده شدند. بهمنظورمشاهده اگزیندانهگردهازروشاستولیزاستفادهشد.
عصارهگیری ازدانه های گرده
به منظور بررسی اثرات آلرژیزایی دانههای گرده ابتدا عصارهگیری از گردهها انجام شد. برای تهیه عصاره گردهای از بافر فسفات نمکی 0.1 M(PBS)،(pH: 7.2) استفاده شد. هر گرم از گردهها در 20 میلی لیتر بافر حل شد (1:20). مخلوط گردهای حاصل به مدت 24 ساعت در دمای 0C 4 روی شیکر به هم زده و در g10000 به مدت 40 دقیقه در 0C 4 سانتریفوژ شد. محلول شناور حاصل را یک شبانه روز دیالیز نموده و سپس تا زمان استفاده در دمای 0c 20-ذخیره گردید ]17 [.
حیوانات آزمایشگاهی
در این پژوهش از حیوانات آزمایشگاهی به عنوان شاخص ارزشیابی تظاهرات آلرژیزایی استفاده شد. حیوانات مورد آزمایش 25 سر رت نر با وزن 190 تا 340 گرم و سن 4تا 5 هفته بودند که از دانشگاه علومپزشکی ایلام خریداری و در5 گروه 5 تایی دسته بندی شدند. به حیوانات به منظور حساس سازی عصاره گردهای تزریق و حیوانات گروه شاهد با همان مقدار PBSتیمار شدند. تزریق با سرنگ توبرکولینی یک میلی لیتر به میزان 75 میکرو لیتر در هر مرتبه بود ]19 [.پسازحساس‌سازی، بهمنظورایمن‌سازیآنهاهریکازعصارههایگردهای دردوتکرار،هرهفتهیکباربهطریقدرونصفاقیتزریقشد.
خون‌گیری از حیوانات
2 ساعت، 8 ساعت ، 24ساعت و یک هفته بعد از آخرین تزریق به ترتیب برای شمارش سلولهای خونی و اندازهگیری IgEتام، خون‌گیری از حیوانات صورت گرفت]14[. بلافاصله بعد از خون‌گیری مقدار 1-0.5 میلی‌لیتر از خون در لوله آغشته به EDTA (برای جلوگیری از انعقاد خون) ریخته شد و از آن برای شمارش سلولهای خونی استفاده گردید]6[. برای اندازهگیری IgE یک میلی‌لیتر از خون هر حیوان سانتریفوژ و سرم آن تفکیک شد. نمونههای خون و سرم برای بررسیهای لازم به آزمایشگاه طبی ابن سینا برده شد.
آزمون پوستی
در آزمون پوستی به روش خراش پوستی (Prick test) درآخرین مرتبه تزریق ایمن‌سازی به صورت زیر پوستی در محل پوست شکم و کشاله ران انجام شد، 24 ساعت قبل از انجام آزمون سطح پوست موش‌های مورد آزمایش را با تیغ استریل تراشیده و محل تزریق را باالکل تمیز کرده، سپس دو قطره از عصاره گرده بر روی پوست گذاشته شد. در محل قطره یک خراش کوچک در پوست ایجاد کرده و واکنش‌های پوستی بین 0.5 تا 2 ساعت با فاصله زمانی نیم ساعت بررسی شدند. بعد از یک هفته تکرار، به منظور بررسی سلولهای خونی، خون‌گیری انجام گرفت. در این روش خون‌گیری از قلب انجام شد]15 [.
نتایج
نتایج ریخت شناسی دانه گرده بلوط
در بررسی مورفولوژی دانه گرده به روش استولیز، دانه گرده بلوط با سه منفدمشاهده شد(تصویر1).
بررسی تکوینی گلهای نربلوط نشان میدهد که بساک از نوع تتراسپورانژ یا چهار کیسه گردهای است. یاختههای توده هاگزا به طور معمول یک تقسیم را گذرانیده، اندازه آن افزایش یافته و یاختههای مادر گرده چندوجهی با رنگ پذیری زیاد و هستههای حجیم را در هر کیسه گرده ایجاد کردهاند(تصویر2الف و ب).هر یک از یاختههای مادر گرده تقسیم با کاهش کروموزومی(میوز) را پشت سر گذاشته (تصویر2ج) و چهار سلول n کروموزومی (هاپلوئید) را به نام تتراسپور به وجود میآورد. همزمان با ورود یاختههای مادر گرده به میوز، دیوار ویژهای توسط همین یاختههای در اطراف یاخته ترشح میشود و آن را احاطه میکند. تیپ تترادی در بلوط از نوع تتراهدرال است. لایه تاپی نیز که داخل ترین لایه بساک و مجاور تتراسپورها قرار دارد، نقش تغذیه‌ای را دارد و از نوع ترشحی است(تصویر3 الف و ب).پس از میوز دیواره ویژه اطراف تتراسپورها فرو رفته و چهار یاختههای جوان میکروسپور را به وجود میآورد. ضمن این مراحل عدهای از یاختههای لایه مغذی ترشحی در کنار بساک باقی ماندهاند و عدهای دیگر حالت آمیبی از دیواره جدا شدهاند و در فضای درونی کیسه بساک در مجاورت دانههای گرده قرار گرفتهاند(تصویر3 ج). در مرحله بعدی نمو میکروسپورها، اطراف هر میکروسپور را دیواره مستقل اگزینی میپوشاند و سپس دیواره درونی در مجاورت پرتوپلاسم به وجود میآید، در این حالت هنوز هسته هر میکروسپور مرکزی است (تصویر4الف). آرام آرام عدهای از یاختههای تاپی محو شده، در میکروسپورها حجم واکوئل افزایش مییابد و میکروسپورهای بالغ تشکیل میشوند. در مراحل پایانی تکوین میکروسپورها سلولهای لایه مغذی از محل اولیه خود جدا شده، در لابه لای میکروسپورهای در حال نمو قرار می‌گیرند(لایه مغذی پلاسمدی یا آمیبی) و مواد حاصل از تجزیه آنها در فضای کیسه گرده رها شده و مورد استفاده دانههای گرده قرار می‌گیرند. سلولهای لایه میانی هم تحلیل می‌روند(تصویر4 ب وج). سپس دانه گرده با سه منفذ تشکیل میشود(تصویر5 الف). در مرحله بعدی، دانههای گرده بالغ برای تقسیم میتوزی آماده میشوند، به طوری که هسته به مرکز آمده و میتوز اتفاق میافتد، این تقسیم نامتقارن است و موجب تشکیل یک هسته حجیم و درشت و یک هسته متراکم و کوچک میشود. هسته حجیم زیر بنای تشکیل یاختههای رویشی و هسته متراکم زیر بنای تشکیل هسته زایشی است. در این مرحله هنوز سلولهای تاپی پلاسمدی یا آمیبی در لابه لای دانههای گردهمشاهده میشوند(تصویر 5 ب).در مرحله بعدی لایه مکانیکی به سمت بساک تحلیل رفته و لایه مکانیکی به سمت خارج بساک آرام آرام به هم میپیوندند. لایه مکانیکی به سمت خارج شکفتگی پیدا کرده و در نهایت شکفتن بساک و آزاد شدن گردههای بالغ را مشاهده میشوند (تصویر 5 ج).
تصویر4الف-میکروسپور بالغ(بزرگنمایی 400×). تصویرب- تکوین دانه های گرده به کمک یاختههای تاپی. (بزرگنمایی 4000×)ب-AT:تاپی آمیبی(بزرگنمایی 1000×) ج-ST:تاپی ترشحی (1000×)
تصویر6 الف-منافذ دانه گرده بالغ بلوط : منفذ دانه گردهP:Pore(بزرگنمایی 4000×) ب-Gn: سلولزایشی و Vn:سلول رویشی(بزرگنمایی 4000×). ج PG: دانه گرده بالغ، ST: محل شکفتن بساک(بزرگنمایی 400×)
نتایج حاصل از آزمون پوستی
بررسی آزمون پوستی با روش [1]SPTنشان داد که در 30 دقیقه اول ابتدا تورم (Wheal) و قرمزی (Flare) بسیار کمی ایجاد شد و 35 دقیقه بعد، خارش در ناحیه تورم مشاهده شد و در نهایت بعد از گذشت 2 ساعت پس از چکاندن عصاره این تحریکات به حداکثر مقدار خود رسید. تورم و قرمزی مشاهده شده نسبت به شاهد (بافر فسفات نمکیPBS) بیشتر بود(تصویر7). حداقل و حداکثر قطر فلر در گروه تیمار شده به ترتیب 5 و 32 میلی متر و در نمونه های کنترل به ترتیب 2.5 و 12.5 میلی متربود(جدول1(.
تصویر7. آزمون پوستی عصاره ، A: کنترل منفی (PBS)،B:تحت تیمار با عصاره 5%دانه های گرده بلوط
جدول 1. مقایسه قطر ویل و فلر در پنج گروه مورد آزمایش
قطر فلر بر حسب میلی متر
قطر ویل یا هاله برحسب میلی متر
حیوان تیمار شده با عصاره 0.5 دانههای گرده بلوط
حیوان شاهد
گروه
حیوان تیمار شده با عصاره 0.5 دانههای گرده بلوط
حیوان شاهد
گروه
2 ساعت
1 ساعت
30 دقیقه
2 ساعت
1 ساعت
30 دقیقه
2 ساعت
1 ساعت
30 دقیقه
2 ساعت
1 ساعت
30 دقیقه
20
32
20
30
25
19
8
13
17
17
5
5
7.5
10
12.5
5
5
6.5
4.5
12
2.5
2.5
5
1.5
7
2.5
1.5
5
-
5
1
2
3
4
5
2
3
2
2
3
1
2
2
1
2
-
1
1
-
2
1
1
-
-
1
1
-
-
-
1
-
-
-
-
-
1
2
3
4
5
بررسی میزان IgE تام
میزان IgE سرمی در خون یکی از بهترین شاخصهای واکنش آلرژیک است. بررسی میزان IgE نشان داد که بیشترین مقدار IgEبا ng/mI 16.16 در نمونه سرولوژی وng/mI8.6در نمونه کنترل تفاوت معنی داری را نشان میدهد(P≤0.05).
جدول2.مقایسه میانگین گروه‌ها برای صفات ارزیابی شده به روش آزمونt-test
گروه
نمونه کنترل
نمونه تحت تیمار با عصاره 5% گرده
IgEng/ml
16.16
8.60
بحث
گیاه بلوط،به عنوان یک گونه گیاهی با ارزش در جهان مطرح است. این گیاه در اقلیم‌های مختلف از نواحی زاگرس یکی از مهم‌ترین درختان فضای سبز است. در اروپا و آمریکا، گزارشهای متعددی در ارتباط با حساستزایی دانههای گرده این گیاه گزارش شده است. از طرفی مطالعات سلول-بافت شناختی بساک و دانههای گرده، میتوانند یک کمک موثر بر تشخیص دقیقتر آلرژنهای گرده گیاه بلوط داشته باشد.مطالعات نمو بساک در بلوط نشان داد کهدر این گیاه لایه میانی، یک لایه موقت یا ناپایدار است و در مرحله جدا شدن تتراسپورها از یکدیگر تجزیه میشوند، که نتایج مشاهدات ما بااکثر دانههای گرده گیاهان نهاندانه دولپهای همسویی دارد.آرایش میکروسپورهای داخل دیواره در گیاه Q. brantiiاز نوع تتراهدرال (چهار وجهی) است. در گزارشهای چهرگانی راد و همکاران در سال 1389اعلام شده است که آرایش تتراسپورها در گیاه CentaureaIberica L. از نوع تتراهدرال است و Gotelli et al. 2008 و Coleman 2005 گزارش کردند که در گیاه Eupatorium laevigatumL. آرایش میکروسپور از نوع تتراهدرال است، که با نتایج ما همسویی دارد ]12و13[.دانهگرده بلوطدوهستهای است این مدل دانه گرده را در اغلب دولپهایها گزارش کردهاند و همین طور سه منفذی است شبیه به دانههای گرده خانواده Asteraceae است که با گزارشهای امجد-مجد برای گردههای بومادران و شریف شوشتری-مجد در ارتباط با گردههای گیاه مارگریت همسویی دارد.
بررسیهای نتایج پوستی و IgE تام نشان میدهد،که دانههای گرده بالغ گیاه بلوط آلرژیزایی قابل توجهی دارند، اما باید روند مطالعات در آینده ادامه داشته باشدبابررسی کمی و کیفی پروتئینهای دانهگرده با انجام آزمون سنجش پروتئین برادفورد و الکتروفورز SDS-PAGE و انجام آزمونهای تکمیلی از جمله وسترن ایمونوبلاتینگ و توالی یابی اسیدهای آمینه و تشخیص نوع آلرژن های اصلی دانههای گرده این گیاه به جزئیات دقیقتری پرداخته و گزارشهای مفصلی به متخصصان آسم وآلرژی داده شود، تا با شناخت هر چه دقیقتر ،بتوان برای بیماران مبتلا به حساسیت فصلی در استان ایلام با توجه توری بودن بلوط در پوشش گیاهی اقدامات لازم را به عمل آورد.
مراجع
[1] پناهی، پ پورمجیدیان،م. جم زاده، ز فلاح، ا 1390. ارزش ریز ریخت شناسی صفات برگ و دانه گرده برای تفکیک گونههای جنس بلوط در جمگهای ایران. فصلنامه علمی پژوهشی تحقیقات جنگل و صنوبر ایران. جلد 19، شماره 1، صفحه 179-163
[2] پناهی، پ. پورهاشم، م. حسینینژاد، م. 1393. آلومتریزیتودهوذخیرةکربنبرگبلوط‌هایباغگیاه‌شناسیملیایران. مجلهزیست‌شناسیایران (مجلهپژوهش‌هایگیاهی). جلد27،شماره1.
[3] حسنی، ا. حسینی، م. رحمانی، ا. آذرفر، د. 1391. تأثیرمرگومیردرختیبرساختارجنگل‌هایبلوطایرانیدراستانایلام. فصلنامةعلمی–پژوهشیتحقیقاتجنگلوصنوبرایران،جلد20شماره4،صفحه577-565.
[4] حیدری، م. پوربابایی، ح. عطار روشن، س. 1389. وضعیتزادآوریطبیعیبلوطایرانیدربینگروه‌هایبوم‌شناختیدرناحیهرویشیکردو - زاگرس. مجلهزیست‌شناسی ایران. جلد24، شماره4.
[5] رضانژاد، ف.1282. بررسی نمو دیواره بساک، میکروسپورزایی، ساختار، پروتئین‌ها و آلرژیزایی دانههای گرده برخی گیاهان پارکهای شهر تهران.پایان نامه دکتری. دانشگاه تربیت معلم، 117-.112
[6] شریفشوشتری،م. مجد، ا. پورپارک، ز. معین، م. 1386. بررسی ویژگیهای ساختاری و توان آلرژی‌زاییگردههای بالغ گیاه مارگریت (Chrysanthemum maximum L)
[7] صفرپور کپورچالی،ش. علیزادهعلیآبادی، ع. قاسمی، ا. صادقی، ا. 1392. مقایسه اثرات ضدباکتریایی عصاره گال بلوط ایرانی روی چند باکتری گرم مثبت و گرم منفی بیماریزای گیاهی. مهار زیستی در گیاه‌پزشکی، جلد1، شماره2.
[10] نجفیفر، ع. 1390. بررسی فراوانی زادآوری جنسی گونههای جنگلی در ارتباط با برخی عوامل اکولوژیکی در جنگلهای بلوط غرب استان ایلام. فصلنامةعلمیپژوهشیتحقیقاتجنگلوصنوبرایران. جلد19شماره2،صفحه290-279.
[11] Chengjiu Huang, Yongtian Zhang& Bruce Bartholomew .1987."Fagaceae". in Flora of China Vol. 4 Page 314. Published by Science Press (Beijing) and Missouri Botanical Garden Press.
[12] Coleman, J. R. 2005. Embryology ancytogenetic of Eupatorium laevigatum (Asteraceae). Genetics and Biology 28: 123-128.
[13] Gotelli, M. M., Galati, B. G. and Medan, D. 2008. Embryology of Helianthus annuus (Asteraceae). AnnalesBotaniciFennici 45:81-96
[14] Gronelberg D A, Bielory L, Fischer S,Bonini, Wahn U. (2003)Animal models of allergic and inflammatory. Conjeuctivitis Allergy. 58:1101-1113.
[15] Hiyoshi K, Takano H, Tomura S, Kumagais y. (2005) Effects of phenanthraquinone on allergic airway inflammation in mice.ClinExp Allergy.35:1243-1248.
[16] Jones, J.H., 1986. Evolution of the Fagaceae: the implications of foliar features. Annals of the Missouri Botanical Garden, 73: 228-275.
[17] Kuldeeps Jaggi, and sharad V. Ganga. (1987) Isolation and identification of pollen allergens of Artemisia. Scoparia J. Allergy clinImmunol. 80:562-72.
[18] Lawrence, G.H.M., 1951. Taxonomy of vascular MacMillan co,. New York, 823 P
[19] Majd A, Ghanati F. (1995) The effect of airpollution on the allergenicity of pinuselderica (pinaceae) pollen. Grana.34: 208-211.
[20] Soepadmo, E., 1972. Fagaceae. Flora Malesiana, Series I, 7 (2): 265-403.
[21] Xue, C. Y., Li, D. Z. (2005) Embryology of Megacodonstylophorusand Veratrillabaillonii(Gentianaceae): description and systematic implication. Botanical Journal oftheLinnean Society 147: 317-331.
ابتدای صفحه