نوع مقاله: مقاله پژوهشی
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
The goal of this study was to evaluate the effects of berberry fruit extracts in the sensitive period of pregnancy on fetal growth and histomorfometric changes in bone tissue of mouse embryo.Twenty pregnant mice were equally divided into four groups. The control group no received any injection. Sham group received distilled water by intra peritoneal injection and two experimental groups received berberry extract in doses of 4 mg/kg (4 experimental group) and 40 mg/kg (40 experimental group) intra peritoneally on days 7, 8 and 9 of gestation. Female mice were killed on 19th gestational day and each fetus was removed and examined for external malformations. Crown-Rump length and placental diameters of each fetus was measured, fixed and processed. Sections take part at 5 micrometer and were stained with H&E technique. Histomorphometrical studies were done on bone tissue of embryos. No significant differences in indicators of embryotoxicity were found among control, sham and 4 mg/kg groups. Our results of 40 mg/kg group showed some malformation such as micromelia, spin bifida, subcutaneous hemorrhage, placenta and fetal atrophy. Mean crown-rump length of the fetuses and mean diameters of placenta in the 40 mg/kg group was significantly decreased compared to control group. Histomorphometric results of fetal tibia bone in 4 and 40 mg/kg groups revealed no significant differences in the mean percentage of volume of perichondrium, trabecula and connective vascular tissues compared to control group. Also no significant difference in mean total volume of bone in the sham, 4 and 40 mg/kg groups compared with control group. Administration of Barberry extract at dose of 4 mg/kg to pregnant mice has acted as a stimulus for bone growth of embryos and slightly positive effects on fetal development, but the administration of Barberry extract at dose of 40 mg/kg to pregnant mice could cause some fetal malformations and reduced fetal osteogenesis. It seems that the response of embryos is dependent on the dose of Berberis, although further investigations are needed.
کلیدواژه‌ها [English]
گیاهان دارویی مشابه داروهای شیمیایی ممکن است اثرات جانبی ناخواسته داشته و سبب آسیب‌های بافتی خصوصا در دوره بارداری روی جنین‌گر شوند. بررسی اثرات جانبی و سمی گیاهان دارویی با انجام آزمایشات تجربی روی حیوانات آزمایشگاهی کمک موثری در شناسایی و تشخیص اثرات مضر داروها بر سیستم‌های بیولوژیک و نیز مراحل رشد و نمو جنین خواهد کرد. گاهی مصرف بیش از حد داروهای گیاهی ممکن است نه‌تنها باعث درمان بیمار نشده بلکه ضایعات جبران‌ناپذیری نیز ایجاد کنند [10]. اغلب خانم‌های باردار با این ذهنیت که استفاده از گیاهان دارویی مشکل‌آفرین و مضر نیستند و عوارضی برای مادر و جنین ندارند، اقدام به خود درمانی با گیاهان دارویی می‌کنند. از این رو لازم است، بررسی‌های مختلفی با مقادیر مصرفی متفاوت روی مدل‌های حیوانی انجام شود تا با شناخت اثرات سوء دارو در بافت‌های مختلف میزان مصرف دقیق و غیرسمی دارو مشخص شود [15].
گیاه زرشک با نام علمی (Berberis integerrima) در دسته گیاهان گلدار، نهاندانه، دولپه و جداگلبرگ قرار دارد و از راسته آلاله ( (Ranals و تیره زرشکیان (Berberidacea) است [14]. از نظر محتوا ترکیبی حدود 4 درصد مواد قندی، 65 درصد اسیدمالیک و اسیدتارتاریک و مقداری صمغ و حاوی اسیدهای سیتریک و ویتامینc و مشتقات آنتوسیانین، رزین و تانن است. [1]. از جمله فواید دارویی زرشک می‌توان به خاصیت رفع تشنگی و عطش شدید به‌خصوص در مناطق گرمسیر کشور اشاره کرد [7]. همچنین از این گیاه در بهبود بیماری‌های کبدی و اسهال خونی آمیبی استفاده می‌شود [2]. از خواص دیگر آن اثرات آنتی اکسیدانی [17]، ضد انگلی، ضد التهابی و کاهنده قند [9]، کلسترول [11]، تری گلیسیرید و فشار خون[17] را می‌توان نام برد. بررسی فیتوشیمیایی نشان داده که ترکیبات گیاه زرشک شامل آلکالوئیدها و ترکیبات فنلی و‌تری ترپنوئید است. در واقع خواص دارویی زرشک به جهت دارا بودن متابولیت‌های ثانویه‌ای چون بربرین، اکسیاکانتین، برمامین، پالماتین، ژات روزیرین است [22].
استفاده صحیح از مواد‌غذایی می‌تواند در افراد ضامن سلامتی آنان باشد گرچه استفاده نادرست و بیش از حد مواد‌غذایی و گیاهان داروئی حتی در بالغان نیز می‌تواند مخل سلامتی فرد شده یا اینکه در دوره بارداری ممکن است موجب اختلال در رشد و نمو و آسیب به جنین و بروز ناهنجاری شود [18]. تحقیقات بسیار محدودی در مورد اثر زرشک بر رشد و نمو جنین صورت گرفته، از جمله مطالعات صادقی فر و همکاران (1375) که نشان دادند که عصاره زرشک با عبور از جفت می‌تواند در رشد و تمایز بافت‌های جنینی تاثیر منفی بگذارد [14]. به‌نظر می‌رسد بررسی اثرات ناخواسته و توکسیک این گیاه به‌عنوان داروی گیاهی در دوره بارداری از اهمیت خاصی برخوردار بوده باشد لذا این مطالعه به منظور بررسی اثرات احتمالی مصرف عصاره این گیاه در روزهای حساس بارداری بر رشد و نمو جنین موش سوری و به‌ویژه بررسی هیستومورفومتریک بافت استخوانی آن به‌عنوان شاخص تراتوژنیک انجام شده است.
نتایج: در گروه‌های شاهد، شم و تجربی 4هیچ‌گونه ناهنجاری ظاهری و بافتی از نظر شاخص‌های تراتوژنیک دیده نشد، درحالی‌که در گروه تجربی 40 ناهنجاری‌هایی نظیر میکروملیا، جنین و جفت آتروفی، اسپینابیفیدا، خونریزی زیر جلدی، جایگاه جفت جذب شده و جفت اضافی دیده شد. در مطالعه میانگین طول سری-دمی جنین‌ها، وزن و قطر جفت‌ها در گروه تجربی 40 نسبت به گروه شاهد کاهش معناداری مشاهده شد. میانگین وزن جنین‌ها در گروه تجربی 40نسبت به گروه شاهد کاهش داشت اما معنادار نبود. بررسی هیستومورفومتری استخوان تیبیای جنین‌های گروه‌های تجربی دوز 4 میلی‌گرم و دوز 40 میلی‌گرم افزایش غیرمعناداری در میانگین درصد حجم اشغال شده توسط پریکندریوم، ترابکولاها و حجم بافت همبندی وعروقی نسبت به گروه شواهد نشان داده. میانگین درصد حجم غضروف در گروه‌های تجربی 4 و 40 در مقایسه با گروه شاهد کاهش یافته گرچه معنادار نبود. همچنین اختلاف معناداری در میانگین حجم کل استخوان درگروه‌های شم و تجربی 4 و تجربی 40 در مقایسه
با گروه شاهد مشاهده نشد.
نتیجه‌گیری: تجویز ٤ میلی‌گرم بر کیلوگرم عصاره زرشک به موش باردار به‌عنوان محرک رشد استخوانی جنین‌ها عمل کرده و به میزان اندکی بر رشد جنین تاثیر مثبت داشته ولی تجویز ٤٠ میلی‌گرم بر کیلوگرم از عصاره زرشک به موش باردار توانسته به اختلال رشد و نمو جنین‌ها از جمله استئوژنزآنها منجر گردد. به نظر می‌رسد که تاثیرپذیری جنین‌ها از عصاره زرشک وابسته به دوز این عصاره است هرچند که بررسی‌های بیشتری را می‌طلبد.
تهیه عصاره زرشک
ابتدا 100 گرم زرشک با آب شهر 2 تا 3 بار شستشو داده شد. در مرحله بعد با 1000 سی‌سی آب مقطر در حال جوش100 گرم زرشک اضافه شد و به مدت 2 ساعت مخلوط شد. محتویات داخل بشر را با قیف و کاغذ صافی صاف کرده و برای به‌دست آوردن عصاره، محلول صاف شده به مدت 12 ساعت در دستگاه بن ماری قرار داده شد. بدین ترتیب از 100 گرم زرشک، 10 گرم عصاره به‌دست آمد.
مطالعه هیستومورفومتری بافت استخوان جنین‌ها
در این تحقیق شاخص‌های هیستومورفومتری استخوان تیبیای جنین‌ها مورد بررسی قرار گرفتند. بدین ترتیب که جهت اندازه‌گیری‌های بافتیبا بزرگنمایی‌های ×100 از میکروسکپ Nikon مجهز به دوربین دیجیتال استفاده شد. بدین منظور از هر مقطع بافت استخوان تیبیا عکس گرفته شد و توسط نرم‌افزار Motic اندازه‌گیری سطوح پریکندر - پریوست، ترابکولا، غضروف و بافت همبندی عروقی برحسب میکرومترمربع انجام گرفت. سپس با استفاده از روش Gaytan و همکاران (1987) حجم پریکندر - پریوست، ترابکولا، غضروف و بافت همبندی عروقی بر حسب میکرومترمکعب توسط فرمول V=ANT (V حجم بافت، A مساحت هر مقطع، Nتعداد مقاطع در هر ناحیه و T ضخامت مقطع) در گروه‌های مختلف اندازه‌گیری و ثبت شد.
مواد و روش‌ها
حیوانات
موش‌های کوچک آزمایشگاهی ماده بالغ از‌نژاد cBalb/ با میانگین وزن7±33گرمدرشرایطاستاندارد)12ساعتنورو12ساعت تاریکی (در دمای2 ± 23 درجه سانتی‌گراد وآبوغذای کافینگهداریشدند. پس از قرار گرفتن شبانه سه موش ماده با یک موش نر در یک قفس و مشاهده پلاک واژینال و مشاهده اسپرم در واژینال اسمیر در صبح روز بعد، روز صفر بارداری تعیین شد. تعداد 20 سر موش باردار به چهار گروه مساوی و برای هر گروه تعداد 5 سر موش تقسیم شدند. گروه شاهد هیچ تزریقی نداشتند. گروه شم آب مقطر و گروه‌های تجربی عصاره زرشک را در مقادیر4 میلی گرم بر کیلوگرم (گروه تجربی 4) و40 میلی‌گرم بر کیلوگرم (گروه تجربی 40) در روزهای 7، 8 و 9 بارداری به‌صورت تزریق داخل صفاقی دریافت کردند.
آماده‌سازی بافتی
موش‌های باردار در پایان روز 19 بارداری با استفاده از دوز بالای کلروفورم کشته شدند و بلافاصله با شکافتنجدارقدامیشکم، شاخ‌های رحمی را باز کرده و جنین‌هابههمراهجفتشان خارج شدند. تمامی جنین‌ها از نظر وجود ناهنجاری‌های ظاهری با استفاده از استریو میکروسکپ مورد بررسی قرار گرفتند. طول سری- دمی جنین‌ها و اقطارکوچکو بزرگجفت آنها نیز با استفاده از کولیس ورنیه اندازه‌گیری شدند. تعداد پنج جنین از هر موش باردار به‌صورت تصادفی انتخاب شدند. پس از فیکس کردن و پردازش جنین‌ها، اندام تحتانی جنین‌ها حد فاصل بالاتر از زانو و پایین‌تر از مفصل مچ پا را قطع نموده و پس از قالب‌گیری با پارافین، مقاطع عرضی به ضخامت 5 میکرون به‌صورت برش‌گیری سریال از بلوک‌ها تهیه شد و مقاطع به نسبت 1 به 4 جمع‌آوری و با هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) رنگ آمیزی شدند.
تجزیهوتحلیلآماری
نتایج بهدستآمدهبا استفاده ازروشآماریآنالیز
واریانسیکطرفهوآزمونتوکیدر نرم‌افزارSpss 13 موردبررسیقرارگرفتند. اطلاعات به‌صورت Mean±SEM ارائهشدهوتفاوتمیانگین‌هادرسطح P<0. 05 معناداردرنظرگرفتهشد.
نتایج
مورفولوژی جنین و جفت‌ها
بررسی‌های مورفولوژی جنین‌ها در گروه‌های مختلف نشان داد که هیچ‌گونه ناهنجاری ظاهری و مورفولوژیک در جنین‌های گروه‌های شاهد، شم و تجربی 4 ملاحظه نشد. تنها در گروه تجربی 40 ناهجاری‌های ظاهری جنینهابه ترتیب 9/1 درصد میکروملیا، 8 /8 درصد اسپینابیفیدا، 6/6 درصد جنین و جفت آتروفی و 4/44 درصد خونریزی زیر جلدی مشاهده شد. (تصویر 1).
|
|
|
تصویر 1- (شکلA)ناهنجاریمیکروملیادرگروهتجربی دوز 40 میلی گرم، (شکلB) اسپینابیفیدا در گروه تجربی 40
(شکل (Cجنین و جفت آتروفیه در گروه تجربی 40
طول سری-دمی (Crown-Rump) جنین‌ها و اقطار جفت‌ها
میانگین طول سری-دمی جنین‌ها و نیز میانگین اقطار بزرگ و کوچک جفت‌ها در گروه تجربی 4 در مقایسه با گروه شاهد و شم تغییر معناداری نداشت. در حالی‌که بررسی میانگین طول سری - دمی جنین‌ها (نمودار1) و میانگین وزن جنین‌ها در گروه‌های تجربی 4 و 40 در مقایسه با گروه شاهد کاهش غیرمعنادار را نشان داد. در حالی‌که میانگین قطر جفت‌ها (نمودار2) در گروه تجربی40، نسبت به گروه شاهد کاهش معناداری داشته است.
نمودار شماره 1- میانگین طول سری-دمی در جنین‌های 19 روزه را در گروه‌های مختلف نشان می‌دهد. میانگین طول سری- دمی در جنین‌های 19 روزه در گروه تجربی 40 در مقایسه با گروه شاهد کاهش معناداری داشته است (p<0. 05).
علامت * نشان‌دهنده وجود اختلاف معنادار با گروه شاهد است. (p<0. 05).
نمودار2- میانگین قطر جفت در جنین‌های 19 روزه در گروه‌های شاهد، شم و در گروه تجربی4 (دوز 4 mg/kg) و در گروه تجربی 40 (دوز 40 mg/kg) را نشان می‌دهد. همان‌طور که در نمودار مشاهده می‌شود، میانگین قطر جفت در جنین‌های 19 روزه در گروه تجربی 40 کاهش معناداری (p<0. 05) را در مقایسه با گروه شاهد نشان می‌دهد.
علامت * نشان‌دهنده وجود اختلاف معنادار با گروه شاهد می‌باشد (p<0. 05).
نتایج هیستومورفومتری
بررسی هیستومورفومتری استخوان تیبیای جنین‌ها در گروه‌های مختلف نشان داد که میانگین حجم کل استخوان تیبیا در گروه شم در مقایسه با گروه شاهد مختصری کاهش یافته که این کاهش معنادار نبود. یافته‌های مورفومتری همچنین نشان داد که میانگین درصد حجم پریکندریوم/ پریوست در گروه‌های شم، تجربی 4 و 40 در مقایسه با گروه شاهد افزایش غیرمعنادار داشته است. به همین ترتیب میانگین درصد حجم ترابکولا در گروه تجربی4 و 40 نسبت به گروه شاهد افزایش غیرمعنادار نشان داد. علاوه بر آن میانگین درصد حجم غضروف در گروه تجربی 4 و 40در مقایسه با گروه شاهد کاهش غیرمعنادار داشت. از سوی دیگر میانگین درصد حجم بافت همبندی عروقی (CVT) در گروه‌های تجربی در مقایسه با گروه شاهد نیز افزایش یافته اما این افزایش معنادار نبود (نمودار 3). همچنین نتایج نشان داد که هیچ‌گونه اختلاف معناداری در میانگین حجم کل استخوان تیبیا در گروه تجربی 4 و 40 در مقایسه با گروه شاهد وجود نداشت (تصویر 3).
نمودار 3- مقایسه میانگین درصد حجمPerichondrium، Trabecula، CartilageوConnective vascular tissue (CVT) در جنین‌های 19روزه موش را در گروه‌های مختلف را نشان می‌دهد. میانگین درصد حجم Perichondrium، Trabecula، Cartilage و CVT بین گروه‌های مورد آزمایش اختلاف معنادار نداشت (بزرگنمایی ×100).
|
|
|
تصویر 3- تصاویر میکروسکوپی از مقاطع عرضی نواحی مختلف تیبیای جنین موش 19 روزه در گروه‌های مختلف: A) گروه شاهد، B) گروه تجربی 4 (دوز 4 mg/kg)، C) گروه تجربی 40 (دوز 40 mg/kg).
افزایش میزان ترابکولاها را در گروه تجربی 4 و 40 نسبت به گروه شاهد نشان می‌دهد گرچه این افزایش معنادار نبود (رنگ آمیزی H&E و بزرگنمایی× 100).
بحث
بررسی اثرات جانبی و سمی گیاهان دارویی کمک موثری در شناسایی اثرات مضر دارو بر سیستم‌های بیولوژیک و نیز مراحل رشد و نمو جنین خواهد کرد. نتایجبهدستآمدهازتحقیقحاضرنشانداد کهجنین‌ها در گروه شاهد و شم ناهنجاری ظاهری نشان ندادند. همچنین استفادهازعصاره زرشکبه میزان4 میلی گرم در هر کیلوگرم از وزن بدن اثرات تراتوژنیکی برمورفولوژیجنین‌های موشبههمراهنداشت. درحالی‌که در گروهی که مقدار 40 میلی‌گرمبهازای هرکیلوگرموزنبدنازعصاره را دریافت کرده بودند، اثرات تراتوژنیک ظاهری روی جنین مشاهده شد. نتایج مطالعه صادقی فر و همکاران (1375) در بررسی اثرات بیولوژیک عصاره‌های آبی و الکلی میوه زرشک روی رشد و نمو جنین موش سوری، نشان داد که طول سری-دمی جنین‌هایی که عصاره آبی زرشک را دریافت کرده بودند در مقایسه با گروه شاهد کاهش یافته است [13]. در مطالعه حاضر نیز طول سری- دمی در جنین‌های گروه تجربی 40 در مقایسه با گروه شاهد کاهش معنادار داشته که با نتایج صادقی‌فر هم خوانی دارد. مشاهده جنین و جفت آتروفی در گروه تجربی40 احتمالا به‌دلیل وجود ترکیب دی هیدروکسیدپالمیتینیوم (DPH) موجود در زرشک است که خاصیت ضد استروژنی داشته و مصرف آن باعث آتروفی شدن آندومتر شده است، بنابراین این تغییرات باعث عدم تغذیه کامل جنین و اختلال در رشد و نمو آن و همچنین عدم خون‌رسانی کافی به جنین و جفت و نیز سبب کاهش رشد جنین می‌شود[4]. از آنجائی‌که زرشک یک ماده قاعده‌آور است که مصرف آن روی لایه‌های رحمی اثر گذاشته و باعث تخریب آندومتر می‌شود در واقع ترکیبات آلکالوئیدی نظیر بنزیل ایزوکینولین موجود در زرشک و پروتوبربرین وترکیبات غیر‌آلکالوئیدی آن مثل اسیدآسکوربیک محرک رحمی هستند با توجه به این موارد می‌توان احتمال داد که زرشک روی سیستم هورمونی بدن نیز ممکن است تاثیر بگذارد و از طریق هورمونی باعث اختلال در رشد و نمو جنین و ادامه بارداری شود و باعث شود که جنین سقط شود
[3-21]. همچنین کاهش قد سری-دمی می‌تواند بیانگر عکس‌العمل سلول‌ها نسبت به کاهش اکسیژن نیز باشد، زیرا بربرین سبب مهار دریافت اکسیژن توسط سلول می‌شود و مصرف اکسیژن را کاهش می‌دهد که این کاهش میزان اکسیژن ممکن سبب تاخیر رشد و نموی جنین و بافت‌های آن شود [19.21].
در این مطالعه جنین‌های آتروفی و جایگاه‌های جفت بدون حضور جنین در گروه تجربی40 حاکی از آتروفی و جذب شدن جنین‌ها شد که با نتایج صادقی‌فر همخوانی دارد که می‌توان احتمال داد که ترکیب دی هیدروکسیدپالمیتینیوم (DPH) موجود در زرشک، خاصیت ضد استروژنی داشته و مصرف آن باعث آتروفی و چروکیده شدن آندومتر شده و این تغییرات باعث سوءتغذیه کامل جنین و اختلال در رشد و نمو آن شده است و همچنین عدم خون‌رسانی کافی به جنین و جفت نیز سبب کاهش رشد جنینی می‌شود[16]. بربرین موجود در زرشک موجب افزایش انقباض رحمی و مانع از ادامه رشد و نمو جنین و موجب سقط جنین می‌شود. بربرین موجب مهار دریافت اکسیژن توسط سلول‌ها و باعث مرگ سلولی می‌شود و توقف رشد و آتروفی شدن جنین را نتیجه می‌دهد. گرچه پاره‌ای از محققان عقب بودن رشد دوران جنین را با وزن جنین ارزیابی می‌کردند [20] ولی پایین بودن وزن جنین الزاما به معنای عقب افتادگی رشد و نمو آن تلقی نمی‌شود. پاره‌ای از محققان چنین نتیجه گرفته‌اند کهجنین‌های گروه تجربی ممکن است وزن کمتریدر مقایسه با گروه شاهد داشته باشند ولی علائم عقب ماندگیو تاخیر رشد استخوان نداشته باشند و عکس این مطلب نیز صادق است [12].
علاوه بر آن به نظر می‌رسد یکی از دلایل کاهش وزن و کاهش طول سری-دمی در جنین‌هایی که به آنها مقدار mg/kg 40 از عصاره آبی میوه زرشک تزریق شده بود نیز به خاطر کاهش عملکرد جفتی باشد به این‌صورت که توسط جفت نواحی تبادل بین مادر و جنین یعنی سطح پرزهای جفتی کاهش می‌یابد در نتیجه توانایی انتقال اکسیژن و مواد‌غذایی از مادر به جنین کمتر می‌شود [23]. لازم به ذکر است که ظرفیت رشد وزنی تا حدود زیادی توسط جفت تعیین می‌شود و رشد جنین وابسته به وزن جفت است [8]جفت به‌عنوان اندامی که ارتباط خونی بین مادر و جنین را ایجاد می‌کند هر عاملی که باعث تغییر در این اندام شود، ممکن است پتانسیل ایجاد تغییر در جنین را نیز داشته باشد [6] هرچند که همیشه ارتباط مستقیم بین آسیب‌پذیری مادر و جنین وجود ندارد گرچه اندام‌ها و بافت‌های جنینی از آستانه آسیب‌پذیری پآیین‌تری در مقایسه با ساختمان‌های مادری برخوردارند سموم و ترکیبات دارویی با دوز پایین می‌توانند باعث بروز آسیب در جنین‌ها شوند که در این میان نقش جفت بسیار با اهمیت است. اینکه نفوذپذیری سد خونی جفتی در برابر یک ترکیب سمی چقدر باشد می‌تواند تعیین کند که آستانه آسیب‌رسانی ماده تراتوژن در چه حدی بوده است. نفوذپذیری بالای سدخونی- جفتی در برابر یک تراتوژن سبب خواهد شد که آن ماده با مقداری به‌مراتب پایین‌تر از مقدار آسیب‌رسان برای مادر، بتواند در جنین ایجاد ناهنجاری نماید. اما اگر سد خونی- جفتی نفوذپذیری پایینی را در برابر یک ماده تراتوژن نشان دهد، آن ماده با مقدار پایین اثر آشکاری را بر مادر و جنین نشان نخواهد داد. اما بالا رفتن مقدار یا مسمومیت مزمن به آن ماده سبب تجمع بیش از حد آن در ساختمان‌های مادری و از جمله جفت‌شده و می‌تواند با آسیب رساندن و ایجاد اختلال در عملکرد طبیعی آنها به‌طور ثانویه سبب آسیب دیدن ساختمان‌های جنینی شود [25].
تغییرات هیستومورفومتریک بافت استخوان در این تحقیق نشان داد که در جنین‌های گروه تجربی دوز 4 و دوز 40 افزایش غیرمعناداری در میانگین درصد حجم اشغال شده توسط پریکوندریم، ترابکولاها و بافت همبندی وعروقی نسبت به گروه شاهد داشت. میانگین درصد حجم غضروف‌ها در گروه تجربی 4 و گروه تجربی 40 در مقایسه با گروه شاهد کاهش یافته ولی معنادار نبود. همچنین اختلاف معناداری در میانگین حجم کل استخوان در گروه‌های تجربی 4 و تجربی 40 در مقایسه با گروه شاهد مشاهده نشد. چنین می‌توان احتمال داد که رشد و نمو این جنین‌ها در اثر عوامل مختلف مختل گردیده و باعث شده که سلول‌ها تحت تاثیر آنزیم‌های لیزوزومی بدن قرارگرفته و اتولیز شده و جذب بدن شود. این مکانیسم جذب جنین معادل مکانیسم سقط جنین در انسان است که این دلایل می‌توانند توجیه‌کننده جایگاه جفت بدون جفت و جنین یا جفت اضافی باشند [14]
در برخی از جنین‌های گروه تجربی40 میکروملیا در اندام تحتانی و اسپینابیفیدا دیده شد. تتراندرین از آلکالوئیدهای زرشک است و نحوه عمل آن مهار سنتز کلاژن است. به نظر می‌رسد که این آلکالوئید زرشک با تاثیر بر سنتز کلاژن و مهار آن روی تشکیل و تکامل استخوان اثر گذاشته و موجب استخوان‌های کوچک غیرعادی و اندام‌های کوتاه در ناهنجاری میکروملیا، شده است. از طرفی ستون فقرات از مهره‌هایی درست شده که پشت سر هم از بالا به پایین ردیف شده‌اند. هرمهره از دو قسمت تشکیل شده است. یک قسمت جلویی که به شکل یک استوانه است و یکقسمت پشتی که شامل تیغه‌های استخوانی است که به نحوی به یکدیگر متصل شده‌اند که یک حلقه را تشکیل می‌دهند. در درون این حلقهنخاع قرار دارد. در اسپینابیفیدا این قسمت حلقوی مشکل داشته و در پشت آن شکافی وجود داردکه این اختلال در تمایز می‌تواند در اثر وجود آلکالوئید تتراندرین در زرشک باشد که نحوه عمل آن مهار سنتز کلاژن است درحالی‌که کلاژن نقش مهمی در سازمان یافتگی استخوان‌ها دارد [3.26]
مطالعات پریور و همکاران نشان داد که اسیدآسکوربیک تاثیر افزایشی روی رشد اندام جلویی موش دارد که این افزایش وابسته به دوز است [27].از آنجایی‌که زرشک حاوی مقادیری از ویتامین C است می‌توان گفت روند افزایشی استخوان‌سازی در اندام عقبی می‌تواند ناشی از وجود ویتامین C در زرشک باشد که نتایج حاصل از آزمایش این مطالعه با این موضوع همخوانی دارد.
از فاکتورهای احتمالی دخیل آلکالوئید موجود در میوه زرشک یعنی بربرین است که یک کاتیون آلی بوده و از غشاء سلول به آسانی عبور کرده و با مولکول DNA تشکیل کمپلکس می‌دهد. این کمپلکس تشکیل شده باعث تغییرات ساختمانی در DNA می‌شود و کارکرد تنظیمی ژن‌ها را تغییر داده و در نهایت در مسیر تمایز اختلال ایجاد می‌کند. مکانی که بربرین در ساختمان DNA قرار می‌گیرد به‌عنوان یک فاکتور مهم در ایجاد اختلافات در القای تمایز است. از طرفی یکی از عملکردهای بربرین مهار عمل آنزیم توپو ایزومراز I و II است. عملکرد این دو آنزیم به این‌گونه است که این آنزیم‌ها روی مارپیچ DNA اثر گذاشته و در نحوه قطع و وصل پیوندهای فسفودی استر شرکت می‌کنند. نبود این آنزیم‌ها از سنتز DNA جلوگیری می‌کند و کاهش یا مهار کامل این آنزیم‌ها باعث ایجاد تغییرات توپولوژیکی در DNA می‌شوند [28]. بنابراین تشکیل کمپلکس پروتو بربرین‌ها و مشتقاتش با DNA می‌تواند باعث توقف رشد جنین شده یا عملکرد این کمپلکس باعث کند شدن رونویسی شده و منجر به آسیب به رشد جنین می‌گردد. پس می‌توان گفت که مصرف بالای عصاره زرشک بر سنتز پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک تاثیر گذاشته و تولید پروتئین و RNA را در سلول‌ها مهار می‌کند. گرچه کاهش لیپید و نیز کاهش گلوکز خون مادر و خون جنین نیز می‌توانند در کاهش رشد جنین موثر باشند [29].
در نتیجه‌گیری نهایی می‌توان گفت که تجویز ٤ میلی گرم بر کیلوگرم عصاره زرشک به موش باردار به‌عنوان محرک رشد استخوانی جنین‌ها عمل کرده است و به میزان اندکی بر رشد جنین تاثیر داشته ولی تجویز ٤٠ میلی‌گرم بر کیلوگرم از عصاره زرشک به موش باردار توانستهتا حدی به اختلال رشد و نمو جنین‌ها از جمله استئوژنزآنهاشود. در پایان چنینبه نظر می‌رسد که تاثیرپذیری جنین‌ها از عصاره زرشک وابسته به دوز این عصاره استو احتیاطات لازم در مورد مصرف بیش از حد زرشک را در دوران بارداری می‌طلبد.
)