بررسی ترمیم نقص استخوان بااستفاده ازغشاءژلاتین-کیتوسان وسلول‌های بنیادی مشتق ازچربی درموش صحرایی(ارزیابی هیستومورفومتری وایمونوهیستولوژیک)

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

چکیده

(ADSCs)سلولهایچنداستعدادیهستندکهقابلیتتمایزبهسلول­هایاستئوژنیکرادارند.ازداربست­هایکیتوسانوژلاتینکهساختاریزیستتخریبپذیروزیستسازگاردارندجهتترمیمبافت­هااستفادهمی­شوند.دراینبررسی60سرموشصحرائیبهطورتصادفیدرپنجگروهقرارگرفتند.1-شاهد:هیچگونهدرمانیدریافتنکردند2-شم:محیطکشتدرمحلنقصتزریقشد3-غشاء:ازژلاتین-کیتوساندرمحلنقصاستخوانیاستفادهشد.4-سلول:پیوندسلول­هایADSCدرمحلنقصانجامشد.5-سلول–غشاء:سلولبههمراهغشاءژلاتین-کیتوساندرمحلنقصپیوندگردید.ارزیابی­هایایمونوهیسیتوشیمیوهیستومورفومتریدرگروه­هایمختلفموردبررسیقرارگرفت.میانگینمساحتترابکولایاستخوانیدرگروه­هایغشاء،سلولوسلول-غشاءنسبتبهگروهشاهدافزایشمعنی­داریرانشانداد.همچنینمیانگینتعداداستئوسیت­هادرناحیهنقصاستخوانیدرگروه­هایسلولوسلول-غشاءنسبتبهگروهشاهدکاهشمعنی­داریداشتندگرچهدرگروهغشاءکاهشبصورتغیرمعنی­دارمشاهدهگردید.بهنظرمی­رسدکهاستفادهازداربستغشاءژلاتین-کیتوسانهمراهباپیوندسلول­هایADSCجهتترمیمنقصاستخوانیموثرباشد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Study of the repair of bone defect using chitosan - gelatin membrane and adipose - derived stem cells in Albino Wistar adult rat (histomorphometrical and immunological evaluations)

چکیده [English]

Adipose - derived stem cells are multipotent cells that capable to differentiate into osteogenic cells, the scaffold of chitosan and gelatin as biodegradable and compatible used for tissues repair.
The control group that received no treatment after the bone defect, 2 sham : that the defect in the bone defect was injected medium, 3- (gelatin - chitosan) that the membrane gelatin - chitosan was used into the bone defect. 4. ADSC: that ADSC cell transplanted into the defect. 5 : (cell - the cell membrane of gelatin – chitosan) was used into the bone defect.  Histomorphometric evaluations in the different groups studied.
The mean area of trabeculae in groups of membranes, cells and cell - membrane significantly increased when compared to the control group. Also the mean number of osteocytes and cells in the bone defect in groups of cells and cell - membrane significantly decreased when compared to the control group. Although in the chitosan - gelatin group, mean number of osteocytes decreased but were not significant.
It seems that use of scaffold of chitosan - gelatin membrane and ADSC cell transplantation to be effective in repair of bone defect.

کلیدواژه‌ها [English]

  • ADSCs
  • Chitosan–Gelatin membrane
  • Cell transplantation
  • Bone Repair
  • Rat

یکیازعوارضشکستگیاستخوان­هاتاخیرویاعدمجوشخوردنکاملآنمیباشد.پوکیاستخوانبهدنبالافزایشسنوعدمجوشخوردنآنپسازشکستگیمی­تواندسببزمینگیرشدنبیماروتحمیلهزینه­هایسنگینبرایفردوجامعهشود[5].محققینهموارهدرصددندتاروشدرمانیمناسبیبرایتسریعجوشخوردناستخوانپیداکنند.پیوندسلول­هایبنیادیتمایزیافتهبهسلول­هایاستخوان­سازامیدهایزیادیرابرایبازسازیضایعاتمذکوربوجودآوردهاست[6-18].درمواردپبوندبافتاستخوانیجهتترمیمضایعاتاستخوانی،تعداداندکسلول­هایاستخوان­سازازمحدودیت­هایسرعتجوشخوردناست[32].

سلول­هایبنیادیمزانشیمی(MSCs)سلول­هایچنداستعدادیاستکهمی­توانندتبدیلبهسلول­هایاستخوانی،غضروفی،فیبروبلاست،عضلانیوغیرهشوند[7].سلول­هایبنیادیرامی­توانازمنابعمختلفازجملهمغزاستخوان،[28]درم،[14]پالپدندان،[17]سینوویوم،[15]ودندانشیریبهدستآورد[29].سلول­هایبنیادیبافتچربیدارایقدرتتمایزیبهسمتسلول­هایمزودرمیمانندچربی،غضروفی،استخوانیوغیرهمی­باشند[9-15].
سلول­هایبنیادیمشتقازچربی،ازنظرفنوتیپمشابهسلول­هایمزانشیممغزاستخوانمی­باشند[12].امامزایایمنحصربهفردآنهاایناستکهاینسلول­هارامی­توانبراحتیازطریقعمللیپوساکشنبهدستآورد[16]ضمنآنکهتعدادسلولدربافتچربیبهمراتببیشترازمغزاستخوانبودهواینسلول­ها
سریع­ترنیزتکثیرمی­یابند[15-33].

امروزهدرمهندسیبافت،داربست­هایزیستتخریبپذیربهعنوانبستریبرایسلول­هایبنیادینساختهمی­شود[18-20].درمواردیکهقسمتوسیعیازاستخوانمثلادرتروماهاازبینمی­رودازپیوندسلول­هایMSCsبهتنهائییادرترکیبباموادزیستتخریب­پذیراستفادهمی­شود[11].درمطالعه­ایکهبررویبیمارانداراینقصاستئوژنزانجامشدنشاندادکهدربیمارانیکهبهآنهاپیوندسلول­هایمزانشیمیزدهشدنهتنهاهیچپاسخایمنیمنفیایجادنگردیدبلکهمیزانمعدنیشدناستخواندراینافرادافزایشقابلملاحظه­ایداشتهاست[21].KyungheeLeeوهمکاران(2010)پسازپیوندhASCs(سلولبنیادیمشتقازچربیانسانی)جهتترمیمنقصاستخواننشاندادندکهترشحعواملمختلفاستخوان­ساز،ازجملهفاکتوررشدکبدیو
پروتئین­هایماتریکسخارجسلولیفعالگردیدهاست.درمجموعیافته­هایانهانشاندادکهhASCsدربهبودترمیماستخوانمفیدبودهومی­تواندروشسودمندیدردرمانپوکیاستخوانباشد[24].

تحقیقحقیقتوهمکاران(2011)نیزنشاندادکهاسفادهازسلول­هایبنیادیمشتقازچربیبرایدرمانضایعاتاستخوانمانیبولدرسگمی­تواندمفیدواقعشود[19].یافته­هایB.Niechodaوهمکاراندرسال2000نیزنشاندادکهترمیمنقصاستخوانرانگوسفندبااستفادهازسلول­هایمزانشیمیمشتقازچربیوسلول­هایمزانشیمیمشتقازمغزاستخوانهمراهباداربستهیدروکسیاپاتیتسببافزایشسرعتترمیماستخوانهایتحتدرمانگردیدهاستگرچهمیزانترمیمنقصاستخواندرگروهدرمانشدهباسلول­هایADSCsدرمقایسهباگروهدرمانشدهباسلولهایBMSCsافزایشقابلملاحظه­ایداشتهاست[4].

هدفازتحقیقحاضربررسیترمیمنقصجزئیاستخوانتوسطداربستسلول­هایبنیادیمشتقازچربی(ADSCs)همراهباغشاءژلاتین–کیتوساندرموشصحراییبااستفادهازروش­هایهیستومورفومتریکوایمونوهیستوشیمیمی­باشد.

 

موادوروش­ها

حیوان:

دراینپژوهشاز60سرموشصحرائینروبالغباوزنحدود250-200گرمنژادالبینو-ویستاراستفادهشد.خوراکدامموش­هابصورتحبهبههمراهآبوبصورتآزاددردسترسموش­هاقرارگرفت.دمایحیوان­خانهحدود2±22وروشناییآنبهطورمتناوبدورهروشناییوتاریکی12ساعتهودرشرایطمطلوبواستانداردحیوان­خانهدانشگاهعلومپزشکیبقیه­اللهنگهداریشدند.نگهداریحیواناتآزمایشگاهیمطابقباراهنمایانستیتویملیسلامتانجامشده‌است.حیواناتبهطورتصادفیبهپنجگروهتقسیمشدند.1-گروهشاهد(Control)شاملحیواناتیکهبررویاستخوانفمورپایراستشاندرناحیهفوقانیاپیفیزدیستالسوراخیبهصورتدوطرفهایجادنمودهوهیچدرمانیدریافتنکردند.2-گروهشم(Sham)گروهیکه72ساعتبعدازایجادآسیب،50میکرولیترازمحیطکشتدرمحلنقصاستخوانتزریقشد.3-گروه(ژلاتین–کیتوسان)کهپسازایجادنقصاستخوانفموروگذشت3روزپیوندغشاءِژلاتین-کیتوساندرمحلآسیبانجامگردید4-گروهسلول((ADSCsکه72ساعتبعدازایجادنقصاستخوانیتعداد150/000سلولADSCsبصورتغیراتولوگودرمحلآسیبتزریقشد5-گروهسلول-غشاء(ADGC)کهنقصاستخوانیدرفمورایجادنمودهو3روزبعد150/000سلولبنیادیمشتقازچربیبههمراهغشاءِژلاتین-کیتوساندرمحلآسیبپیوندمیگردد.

 

روشتهیهغشاء:

ابتداکیتوزان(Ch)بانسبت1%وزنیبهمحلولآبمقطر2بارتقطیرکهبادرجهحرارت40درجهسانتی­گراداضافهشدمحلولحاصلبوسیله­یبوسیلهدستگاههمزنمخلوطشد.سپسمیزان0/5میلیلیتراسیداستیکخالصبهآناضافهوژلاتینبانسبت1%وزنیبهآناضافهوبهدمایجوشرساندهشد.محلولحاصلبوسیلهیاتوکلاواستریلگردید.

 

استخراجسلول:

ازحفرهشکمیحیوانچربیبرداشتهشدوپسازخردشدن،با40λکلاژناژو2میلیلیترمحیطکشتαMEMمخلوطگردیدوبهمدت30تا15دقیقهبوسیلهدستگاههمزنبههمزدهشدتازمانیکهیکمحلولکاملاًشیریرنگبهدستآمد.محلول،ازفیلترمش70میکرومتریعبوردادهوبهدنبالآندوباربهمدت4دقیقهوبادور3000،سانتریفیوژشدمحلولرویی،دورریختهشدوترکیبباقیمانده،بامحیطکشتمخلوطگردیدودریکپلیتریختهوسپسداخلانکوباتورقرارگرفت.بهمدت3روز،محیطروییتوسطسمپلرکشیدهشدوبهآنمحیطکشتجدیداضافهگردید.تاسلول­هابهکفپلیتبچسبند.بعدازپاساژدوم،سلول­هاآمادهپیوندشدند.

 

مرحلهکشتسلولADSCبررویغشاءکیتوسانژلاتین:

پسازتهیهغشاءوقراردادنقطعات1×1
سانتی­مترآنبهمدتیکهفتهدرمحیطکشتαMEMحاویسرم،آنرابهوسیلهمحلولPBSوالکل96درصدشستشودادهوغشاءهادرپلیت­هایششخانهایاستریلدرزیرهودقرارگرفتهوبهکفپلیت­هایآغشتهبهمحلولژلاتیناستریلیکدرصدمنتقلگردیدند.سپسقطعاتغشاءرابهآرامیبررویپلیتپهننمودهوکمیدرداخلهودقراردادهتاخشکشوند.دراینهنگامسلول­هایاستروماییراازکفپلیتبهوسیلهآنزیمتربپسینجداکردهوبررویغشاءریختهوکمیمحیطکشتحاویمحلولسرمگاویبهآناضافهگردیدند.سپسپلیت­هادردستگاهانکوباتورقراردادهشدند.پسازدوروزغشاء­هارادرزیرمیکروسکوپمشاهدهکردهتاازوجودسلولاستروماییاطمینانحاصلشود.

 

ایجادنقصاستخوانی:

حیواناتبهوسیلهمخلوطکتامینهیدروکلرید
(60mg/kg)وزایلیزینهیدروکلرید10mg/kg))بیهوششدهوپسازآن،مویپایحیوانتراشیدهشدوپوستخلفیخارجیران،توسطبتادینوالکلاستریلشد.بهمنظورایجادنقصاستخوانبااستفادهازجراحی،پسازبی­هوشکردنحیوانات،سطحخارجیناحیهرانراستآن­هاتراشیدهشدوبابتادیناستریلگردید.سپسبرشیبهطولدوسانتیمتردرناحیهخارجیپایراستحیواناتایجادوپسازکنارزدنعضلاتوفاسیاها،استخوانفموردرمعرضدیدقرارگرفت،سپسسوراخیبهقطر١میلی­متربهصورتدوطرفه(Transcortical)درناحیهبالایاپیفیزدیستالاستخوانفمورایجادگردیدودرپایانعضلاتوپوستبهوسیلهنخ۴صفرقابلجذبدوختهشدومراقبت­هایپسازعملجراحیازحیواناتبهعملآمد.پسازگذشت٧٢ساعتازجراحیناحیهعملمجدداًبازشدودرگروه­هایپیوندسلولمقدار٥٠میکرولیترمحیطکشت
حاوی000/150سلولنشان­دارشدهبا
(BrduSIGMA,USA)(که٧٢ساعتقبلازپیونددرمعرضBrduباغلظت5/1میلیمولارقرارگرفتهبودند)ودرگروهشمفقط٥٠میکرولیترمحیطکشتتزریقشد.درگروهغشاءکهغشاءژلاتین-کبتوساندرمحلنقصاستخوانیپیوندزدهشدوگروهسلولغشاءکهغشاییکهسلولرویآنکشتدادهشدهبوددرمحلنقصپیوندزدهشدوسپسعضلاتوپوستمجدداًبانخ۴صفرقابلجذبدوختهشد.

 

نمونهبرداریازحیوانات:

موش­ها28روزبعدازجراحیدومبااستفادهازدوزبالایکلروفورمکشتهشدهوپسازبرداشتناستخوان­ها،ارزیابی­هایهیستومورفومتریکوایمونوهیستوشیمیبررویآنهاصورتگرفت.

 

-شمارشسلولیوبررسیمیزانزندهبودنسلول­ها((Viabilitytest:

برایمشخصکردنزندهبودنسلول­ها،بهنسبتمساویحجمیازسوسپانسیونسلولیوتریپانبلو(4/0درصد)بررویلامنئوبارریختهوسلول­هایزندهومردهتوسطمیکروسکوپاینورتبابزرگنمایی٤٠٠بررسیوشمارشگردیدندوازآنجائیکهسلول­هایمردهتوسطتریپانبلوبهرنگآبیدر
می­آیندوسلولهایزندهشفافمی­باشند،تعدادسلول­هایزندهومردهشمارششدهودرصدآن­هامحاسبهوثبتگردیدند.

 

مشخصنمودناستروماییبودنسلول­هایADSCsبااستفادهازروشایمونوسایتوشیمی:

برایتعییندرصدخلوصسلول­هایاسترومائی،بهدلیلوجودگلیکوپروتئینفیبرونکتینوCD44درسلول­هایبامنشأمزانشیمی،سلول­هایADSCsبرعلیهاینگلیکوپروتئین­هابهروشایمونوسایتوشیمیرنگشدند[3].بدینمنظورابتداسلول­هایADSCsموجوددرپلیتتوسطپارافرمالدئید٤درصدبهمدت٣٠دقیقهفیکسشده،سپسشستشویسلولهاباPBSسهباروهربار٥دقیقهانجامشد.نمونههادرمعرضمحلولبلوککننده(مخلوطسرمبز١٠درصدوTritonX-100درصد3/0)بهمدتیکساعتقراردادهشد.پسازرقیقنمودن(1:100)آنتی­بادی­هایاولیهCD44و(AB-CAM)Fibronectinکههردوازنوعموشیبودند،هرکدامرابهطورمجزابررویسلول­هاریختهوپلیترادرداخلظرفمرطوببهمدتیکشبودردمای°C4انکوبهشدند.پلیت­هاپسازشستشوباPBSدرمعرضH2O210درصدبهمدت۳۰دقیقهقرارگرفتند.سپسباPBSسهبارشستشوانجامشدوبهمدتدوساعتدردمایمحیطدرمعرض
آنتی­بادیثانویهضدموشی(AB-CAM)AvidinBiotin(1:200)قرارگرفتند.سپسدهدقیقهتحتتأثیرمحلولکروموژنDABودرتاریکیقرارگرفتندوبعدازشستشوباPBSسلول­هاتوسطمیکروسکوپInvertموردبررسیقرارگرفتند.

 

مطالعههیستومورفومتری:

جهتبررسیمیزانترابکولاموجوددرمحلکالاستخوانیازمجموعهسخت­افزاری(کامپیوترومیکروسکوپمتصلبهدوربین(Tsviewوسیستمنرم­افزاریMoticاستفادهشد.بدینترتیبکهازهرنمونهاستخوانپسازکلسیمزداییبااسیدفرمیک۱۰درصدوفیکساسیونوپردازشبافتی،مقاطعطولیسریالی5میکرونیازنمونه­هاتهیهوبانسبت۱به۴تعداد۷مقطعازناحیهکالتهیهورنگ­آمیزیهماتوکسیلین-ائوزینانجامگردیدجهتمطالعههیستومورفومتری،ازمقاطعبافتی،تصاویربابزرگنمائی100برابرتهیهومیزانترابکولاهاوبافتهمبندیعروقیدرمساحتیبرابربا50000میکرومترمربعاندازه­گیریوثبتگردیدند.

 

شمارشسلولی:

تعداداستئوسیت­هایموجوددرتیغه­هایاستخوانیدرسطحیمعادل50000میکرومترمربعبابزرگنمائی٤٠٠برابرمحاسبهوثبتگردیدند.

تجزیهوتحلیلاطلاعات:ارزیابیآماریداده­هابااستفادهازآزمونآماریANOVAوآزمونتکمیلیTukeyPostHockانجامشد.درانجامآزمونهایآماریازنرم­افزارSPSSاستفادهگردید.کلیهاطلاعاتارائهشدهبرحسبMean±SEMمی­باشد.میزان
P<0.05بهعنواندرجهمعنی­داریدرنظرگرفتهشد.

 

نتایج

زندهبودنسلول­ها

نتایجviabilitytestنشاندادکهتقریباًبیشاز88درصدسلول­هایADSCsپسازپاساژچهارمزندهبودند.

 

درصدسلول­هایADSCsبااستفادهازروشایمونوسیتوشیمی:

قبلازپیوندسلول­هایADSCsدرصدسلول­هاینشاندارشدهباآنتی­بادی­هایفیبرونکتینوCD44بررسیوبهترتیببیشاز۹3و۹۵درصدمشخصگردیدند(تصویر1).

 

هیستومورفومتریبافتاستخوان:

اندازه­گیریمساحتترابکولاهایاستخواندرناحیهکالنشاندادکهوسعتناحیهترمیمشدهنسبتبهوسعتکلناحیهکالاستخوانیدرگروههایشاهد(023/0±70/0)،شم(020/0±699/0)،غشاء(014/0±86/0)،سلول(017/0±84/0)وسلول-غشاء(011/0±86/0)بودهاست.

 

 

 

تصویر۱:تصویرمیکروسکوپیسلولهایاستروماییپسازانجامایمونوسیتوشیمیبابزرگنمایی۴۰۰برابر.تصویر(A)،(B)،(C)بهترتیبمربوطبهآنتیبادیفیبرونکتین،CD44وکنترلمنفیسلولهایADSC24ساعتپسازپاساژچهارماست.سلولهادرتصاویرAوBبهدلیلدارابودننشانگرهایفیبرونکتینوCD44رنگDABگرفتهوبهرنگقهوهایدیدهشوند.

 

 

تصویر2-تصاویرمقاطعبافتاستخوانیمنطقهترمیمشدهمربوطبهگروههایشاهد(A)،شم(B)،غشاء(C)،سلولدرمانی(D)وسلول-غشاء(E)درپایانهفتهچهارم.ترابکولاراستخوان(TR)،فضاهایپیوندیعروفی.(CO)(رنگآمیزی،H&EبزرگنمائیX١٠٠(


مساحتترابکولاهایاستخوانیگروهشمدرمقایسهباگروهشاهدتفاوتمعنادارینشاننداد.ولیاینمساحتدرسهگروهغشاء،سلولوسلول-غشاءنسبتبهگروهشاهددارایافزایشمعناداربودهاست(درهرسهگروهP<0/001).کهبیانگرافزایشقابلتوجهمیزانترابکولاهایاستخوانینسبتبهمساحتکلناحیهکالدرسهگروهغشاء،سلولوسلول-غشاءمی­باشد.میانگینمساحتترابکولاهایاستخوانیدرسهگروهغشاء،سلولوسلول-غشاءنسبتبهگروهشمافزایشمعنادارینشاندادهاست(P<0/001).همچنینمساحتترابکولاهایاستخوانیدرگروههایسلولوسلول-غشاءنسبتبهگروهغشاءاختلافمعناداریرانشاننداد.علاوهبرآنمیزانترابکولاهایاستخوانیشکلگرفتهدرناحیهکالدرگروهسلول-غشاءنسبتبهگروهسلولتفاوتمعنادارینداشتهاست(نمودار1).

بررسیبافتهمبندی-عروقیدرناحیهنقصاستخوانینشاندادکهمیانگینوسعتبافتهمبندی-عروقینسبتبهوسعتکلناحیهکالدرگروه­هایشاهد(02/0±3/0)،شم(02/0±3/0)،غشاء(014/0±14/0)،سلول(017/0±15/0)وغشاء-سلول(011/0±13/0)بودهاست.

مقایسهاینشاخصبینگروه­هایشاهدوشمهیچاختلافمعنادارینشاننداد،درصورتیکهاینشاخصدرهرسهگروهغشاء،سلولوسلول-غشاءنسبتبهگروهشاهدکاهشمعناداریرانشانداد(درهرسهP<0/001).بههمینترتیبمشاهدهگردیدکهمیانگیننسبتبافتهمبندی-عروقیبهکلناحیهکالدرهرسهگروهغشاء،سلولوسلول-غشاءدرمقایسهباگروهشمکاهشمعناداریداشتهاست(درهرسهP<0/001)،کهنشاندهندهکاهشقابلتوجهبافتهمبندی-عروقینسبتبهکلناحیهکالدرهرسهگروهمی­باشد.درادامهبررسی­هامشخصشدکهمیانگیننسبتبافتهمبندی-عروقیبهکلناحیهکالدرگروه­هایسلول،سلول-غشاءنسبتبهگروهغشاءفاقداختلافمعناداربودهاست.علاوهبرآنمیانگیننسبتبافتهمبندی-عروقیبهکلناحیهکالدرگروهغشاء–سلولنسبتبهگروهسلولتفاوتمعنی­داریملاحظهنگردید(نمودار2).


 

 

نمودار1-میانگینمساحتترابکولاهایاستخواننسبتبهمساحتکلناحیهترمیمشدهدرمحلنقصبرحسبمیکرومترمربعدرچهارهفتهبعدازپیوند.میانگینمساحتترابکولاهایاستخواننسبتبهمساحتکلناحیهترمیمشدهدرمحلنقصبرحسبمیکرومترمربعدرچهارهفتهبعدازپیوند.گروهشاهدوشمتفاوتمعنیداریرابایکدیگرنشاننمیدهند.

*اختلافمعنیدارباگروهشاهد(P<0/05)

 

 

نمودار2-میانگیننسبتمساحتبافتهمبندی-عروقیاستخوانبهمساحتکلناحیهترمیمشدهدرمحلنقصبرحسبمیکرومترمربعدرچهارهفتهبعدازپیوند.ایننسبتدرگروهشاهدوشماختلافقابلتوجهینداشتند.

*اختلافمعنیدارباگروهشاهد(P<0/05)

 


تعداداستئوسیت­ها:

بررسیوشمارشتعداداستئوسیت­هادرسطحیبرابر50000میکرومترمربعازترابکولاهایناحیهنقصاستخوانیبابزرگنمایی400برابردرگروه­هایمختلفنشاندادکهمیانگینتعداداستئوسیت­هادرگروه­هایشاهد(82/16±47/72)،شم(9/2±24/55)،غشاء(25/10±62/51)،سلول(74/3±78/25)،سلول-غشاء(98/0±88/32)بود.ایننتایجنشاندادکهمیانگینتعداداستئوسیت­هادرگروه­هایشموغشاءنسبتبهگروهشاهدکاهشغیر

معنادارودرگروهسلولوسلول-غشاءکاهشمعناداربودهاست(درهردوگروه001/0P<)،ضمناینکهمیانگینتعداداستئوسیت­هادرگروهغشاء،سلولوسلول-غشاءدرمقایسهباگروهشمدارایاختلافمعنادارنبودهاست.همچنینمیانگینتعداداستئوسیت­هادرگروهسلولوسلول-غشاءنسبتبهگروهغشاءءکاهشغیرمعنادارداشتهامامیانگینتعداداستئوسیت­هادرگروهسلول-غشاءدرمقایسهباگروهسلولافزایشغیرمعنی­دارنشاندادهاست(تصویر2)(نمودار3).


 

 

نمودار3-تعداداستئوسیت­هادر50000میکرومترمربعازترابکولایاستخواندرمحلآسیبچهارهفتهبعدازپیوند.

میانگینتعداداستئوسیت­هامیانگروه­هایشاهد،شموغشاءفاقداختلافمعنی­داربود.

*اختلافمعنیدارباگروهشاهد(P<0/05)

 

 

تصویر2-تصاویرناحیهنقصاستخوانیفمورکهنشاندهندهتعدادوآرایشاستئوسیت­هادرگروه­هایمختلفمی­باشد.گروهشاهد(A)،
گروهشم(
B)،گروهغشاء(C)،گروهسلول(D)گروهسلول-غشاء(E).پیکانقرمزاشارهبهسلول­هایاستئوسیتبیانگرترابکولایاستخوانمی­باشد.(رنگآمیزی،H&EبزرگنمائیX4٠٠(

 


ردیابیسلول­هایتزریقشدهبهروشایمونوهیستوشیمی

درپایانهفتهچهارمازناحیهنقصاستخوانیازگروه­هایمختلفمقاطعپارافینیبهضخامت5

میکرومترتهیهگردیدووجودسلول­هاینشاندارشدهموجوددرمحلترمیماستخوانبااستفادهازروشایمنوهیستوشیمیوبهره­گیریازآنتیBrduردیابیوتاییدگردیدند(تصویر3).


 

تصویر3-سلول­هایردیابیشدهADSCچهارهفتهبعدازپیوندسلول.پیوندغشاء(A)،پیوندسلول(B)،پیوندسلول-غشاء(D)وکنترلمنفی(C)بابزرگنمائی100برابر.پیکانسیاهاشارهبههستهسلول­هاینشاندارداردکهدرAوBوDبهرنگقهوه­ایدیدهمی­شودامادرCرنگنگرفتهوبهرنگبنفشدیدهمی­شود.


بحث

امروزهازﺳﻠﻮلﻫﺎیﺑﻨﻴﺎدیﻣﺰاﻧﺸﻴﻤﻲمشتقازﺑﺎﻓﺖچربیونیزدارﺑﺴﺖ­هایزیستتخریبپذیرجهتترمیمنقائصاستخوانیاستفادهمی­شود[10].

یافته­هایهیستومورفومتریاینتحقیقچهارهفتهبعدازپیوندبیانگرافزایشمساحتترابکولاهایاستخوانیوکاهشبافتهمبندی-عروقیدرگروهایپیوندسلولنسبتبهگروهشاهدبودهاست.تعداداستئوسیت­هادرناحیهترمیمدرگروه­هایپیوندسلولوسلولغشاءنسبتبهگروهشاهدکاهشمعنی­دارینشانداد.درتحقیقحاضربهنظرمی­رسدکهدرگروهتجربیبهدلیلکشتسلول­هادرمحیططبیعیومناسبترمیماستخوانیبهترانجامشدهاستامادرگروهشاهدبهعلتمحیطاسیدیوکمبوداکسیژنسلول­هایاتوژنوساستخوانیبهزمانبیشتریبرایتکثیروترمیمنیازداشتندوبههمیندلیلنسبتگروهپیوندسلولازترمیمضعیف­تریبرخورداربوده­اند[3].

مشابهنتایجگروهسلول-غشاءمایافته­هایSchliephakeوهمکاران(2009)می­باشدزیراایشاننیزبهمنظورافزایشاثربخشیسلولهایبنیادیازداربستکلاژنبرایتمایزوگسترشسلول­هایبنیادیاستفادهنمودندکهنتایجخوبیجهتتسریعرشداستخوانبدستآوردند[30].تحقیقاتدیگرینیزنشانداده­اندکهپسازایجادنقصاستخوانیدربزوگوسفندومتعاقبآنپیوندسلولمزانشیمی،میزانترمیمدراستخوان­هایگروهتجربیبهطورچشمگیریافزایشیافتهبود[2].

نتایجارزیابیهیستولوژیکنقصاستخوانرادیالخرگوشدرتحقیقKimوهمکاراننیزمشابه
یافته­هایتحقیقحاضرمی­باشدزیراایشاننیزنشاندادندکهپیوندسلول­هایاتولوگاستئوبلاست،استخوان­سازیرادرناحیهنقصاستخوانیالقاءوتحریکمی­کند[23].بههمینترتیبB.Niechodaوهمکاراندرسال2000نشاندادندکهترمیمنقصاستخوانرانگوسفندبااستفادهازسلول­هایمزانشیمیمشتقازچربیوسلول­هایمزانشیمیمشتقازمغزاستخوانهمراهباداربستهیدروکسیاپاتیتسببافزایشسرعتترمیماستخوان­هایتحتدرمانگشتهاست،گرچهمیزانترمیمنقصاستخواندرگروهدرمانشدهباسلول­هایADSCsدرمقایسهباگروهدرمانشدهباسلول­هایBMSCsافزایشقابلملاحظهایداشتهاست[4].

همچنینهمسوبایافته­هایمامطالعه­یLiuBوهمکاران(2009)می­باشدکهایشاننیزبرایترمیمنقصاستخوانجمجمهسگازپیونداتولوگسلولADSCsوداربست­هایمرجانی(Coral(scaffoldاستفادهنمودند.نتایجاینتحقیقنشاندادکهسلولاتولوگADSCsوداربست­هایمرجانیمی­توانندسببترمیمسریعترنقصاستخوانجمجمهدرسگشوندبطوریکهگروهتجربیدارایافزایشمعنی­دارنسبتبهگروهشاهدبود[26]،کهبایافته­هایهرسهگروهسلول،غشاءوسلول-غشاءتحقیقما،خصوصاباگروهسلول-غشاءمطابقتدارد.مشابهنتایجتحقیقمامطالعاتدیگریدیدهمی­شودازجملهتحقیقKyungheeLeeوهمکاران(2010)پسازپیوندhASCs(سلولبنیادیمشتقازچربیانسانی)استکهجهتترمیمنقصاستخوانملاحظهکردندکهترشحعواملمختلفاستخوان­ساز،مانندفاکتوررشدکبدیوپروتئین­هایماتریکسخارجسلولیفعالگردیدهوhASCsدربهبودترمیماستخواننقش

موثریراایفانمودهاستکهمی­تواندروشسودمندیبرایدرمانپوکیاستخوانبهحسابآید[24].همچنینتحقیقAbukawaوهمکاراندرسال2004بودهاستکهبررویخوکانجامشدهوپیونداتولوگازسلولهایبنیادیمشقازچربیدرخوککهباDاسیدL-لاکتیکگلیکولیککشتدادهوبهفکپاییناسیبدیدهمنتقلگردیدند،بررسیمحلنقصاستخوانینشاندادکهبافتاستخوانیتشکیلشدهدرمحلاسیبدرگروهدرمانینسبتبهگروهشاهدافزایشقابلملاحظهایداشتهاست[1].درتحقیقدیگریکهدرسال2010توسطNatherوهمکاراناوصورتگرفتازپیونداتولوگسلولهایبنیادیمزانشیمیبرایترمیمآلوگرافتنقصاستخوانفموردرخرگوشاستفادهگردیدونتایجآنبهبودوضعیتترمیماستخوانوافزایشسلول­هایاستخوانیدرناحیهدیافیزفمورمتعاقبپیوندآلوگرافتبودهاست[27].کهتمامینتایجاینمحققیندرراستاییافته­هایتحقیقمانیزمی­باشد.

همچنیننتایجمثبتیازپیوندسلولهایبنیادیدرترمیمنقصاستخوانیوبااستفادهازداربستساختهشدهتوسطDupontگزارششدهاستگرچهایشاننتوانستندسلولهایبنیادیپیوندزدهشدهرادرمحلترمیماستخوانردیابیوشناساییکنند[13].درتحقیقدیگریکهCaoوهمکارانبررویمدلحیوانیبزهایاستئوپروتیکانجامدادندوازپیونداتولوگسلول­هایMSCsبرایدرماناستئوپروزاستفادهکردند.پسازبررسی­هایهیستومورفومتریاستخوانهایفموراینحیواناتبعدازشانزدههفتهنشاندادندکهترابکولاهایاستخوانیونیزتعدادترابکولا­هادرناحیهنقصاستخوانیدرگروه­هایتجربینسبتبهگروهکنترلافزایشمعنی­داری
داشته­اند[8]کهیافتههایاینتحقیقدرزمینهسلولبانتایجماهمخوانیداردگرچهدرتحقیقمادرگروهسلولنسبتبهگروهغشاءاختلافمعنیداریدیدهنشد.

علیرغماینکهاکثرنتایجبدستآمدهازپیوندسلول­هایبنیادینشاندهندهتسریعدرروندترمیماستخوانمیباشدوبسیاریازایننتایجبایکدیگروبایافته­هایتحقیقحاضرمشابهتدارندولیدرتعدادیازتحقیقات،نتایجمتفاوتبایافته­هایمانیزدیده
می­شوند.برایمثالنتایجStockmanوهمکارانرامیتوانذکرنمودزیراایشانپسازپیونداتولوگسلول­هایاسترومائیمغزاستخوانهمراهباداربستکلاژندرمحلنقصاستخوانجمجمهخوک،وبررسی­هایهیستولوژیکایشاننشاندادکهمیزانکالاستخوانیسیروزبعدازپیونددرگروهتجربیکهپیوندسلولهمراهباکلاژندریافتکردهانددرمقایسهباگروهکنترلکهدرآنهاتنهاازکلاژناستفادهشدهبود،افزایشمعنیدارینداشت.[31]،کهاینیافتههاتاحدیمتفاوتبانتایجهیستومورفومتریماوتعدادزیادیازمحققینمی­باشد[1.2.13.23.24.26.27.30].چنینبهنظرمی­رسدکهپیوندسلول­هایبنیادیمشتقازچربی،درمحلنقصاستخوانسببتمایزوتبدیلاینسلول­هابهاستئوبلاستوتسریعرونداستخوان­سازیمی­شوند.درواقع،پیوندسلول­هایبنیادیمشتقازچربیبهمحلنقصاستخوان،میزانرونداستئوژنزرادراستخوانبالابردهکهنتیجهآن،افزایشسرعتتشکیلوتحکیمکالاستخوانیمی­باشد.ترمیمنقصاستخوانپسازپیوندسلول­هایADSCsوتمایزبهسلول­هایاستخوانی،اجزایضروریبرایتشکیلاستخوانرافراهممی­آورد.

نتیجه­گیری

نتایجهیستومورفومتریوایمونوهیستوشیمیتحقیقحاضرنشاندادکهروندترمیماستخواندرمحلنقصجزئیاستخوانیدرموشصحرائی،بااستفادهپیوندغشاءژلاتین-کیتوسانوسلولهایبنیادیمشتقازچربیسببافزایشسرعتترمیموبازسازیاستخوانمی­شود.

 

[1]    Abukawa H, Shin M, Williams WB, Vacanti JP, Kaban LB, Troulis MJ. 2004.Reconstruction of mandibular defects with autologous tissue-engineered bone. J Oral MaxillofacSurg. ;62:601–6. [PubMed]

[2]    Arthur, A. Zannettino, A AND Gronthos, S. 2009 .The Therapeutic Applications of MultipotentialMesenchymalStromal Stem Cells in Skeletal Tissue Repair. J. Cell. Physiol., 218: 237–245.

[3]    Ashton BA, Allen RD, Howlett CR, Eaglesom CC, Hatton A, Owen M. 1980 .Formation of bone andcartilage by marrow stromal cells in diffusion chambers in vivo. ClinOrthopRelatRes;(151):294-307.

[4]    B. Niechoda,Y. YuandW.R. Walsh .2000. Healing bon with adipose tissue derived stromal stem cells – the histomorfhometry of the ovin defect model. Orthopaedic Research Laboratories, Prince of Wales Hospital, University of New South Wales, Sydney, Australia:

[5]    Brownlow HC, Simpson AH. 2000.Metabolic activity of a new atrophic nonunion model in rabbits. J OrthopRes  May; 18(3):438-42.

[6]    Bruder SP, Kraus KH, Goldberg VM, Kadiyala S. 1998.The effect of implants loaded with autologous mesenchymal stem cells on the healing of canine segmental bone defects. J Bone Joint Surg Am;  80:985–996.

[7]    Bunnell BA, Flaat M, Gagliardi C, Patel B, Ripoll C.2008. Adipose-derived stem cells: Isolation, expansion and differentiation.Methods;45:115–20.

[8]    Cao L, Liu, G. Gan, Y. Zhang, X. Tang, T. Dai, K. et al. (2012). The use of autologous enriched bone marrow MSCs to enhance osteoporoticbone defect repair in long-term estrogen deficient goats. Biomaterials 33و 5076e5084.

[9]    Cheryl, T., Gomillion, Karen J.L. 2006, Stem cells and adipose tissue engineering. Biomaterials;.27:6052–6063.

[10]Choi JH, Gimble JM, Lee K, Marra KG, Rubin JP, Yoo JJ, et al .2010.Adipose tissue engineering for soft tissue regeneration. Tissue EngPart B Rev;16(4):413-26.

[11]Crha, M. Nečas, A. Srnec, R. Janovec, J. Stehlík, L. Raušer, P. et al. (2009). Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Regeneration and Application to Bone Healing. ACTA VET. BRNO, 78: 635-642.

[12]De Ugarte DA, Morizono K, Elbarbary A, Alfonso Z, Zuk PA, Zhu M, et al. 2003.Comparison of multi-lineage cells fromhuman adipose tissue and bone marrow. Cells Tissues Organs.; 174(3): 101-9.

[13]Dupont KM, Sharma K, Stevens HY, Boerckel JD, García AJ, Guldberg RE. 2010. Human stem cell delivery for treatment of large segmental bone defects. Proc Natl AcadSci U S A. Feb 23;107(8):3305-10.

[14]Elahi M, Kabirsoleimani M, Shiravi A. 2011. Investigate the possibility ofusing enzymes to extract mesenchymal stem cells from human adipose tissue. J Med Res;4(35):200-80. [Persian]

[15]Fan J, Varshney RR, Ren L, Cai D, Wang DA. 2009. Synovium-derived mesenchymal stem cells: A new cell source for musculoskeletal regeneration. Tissue Eng Part B Rev.;15:75–86. [PubMed]

 

[16]Gimble JM, Katz AJ, Bunnell BA. 2007. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res; 100(9):

[17]Goldberg V.M. and Caplan A.I., 2004.Orthopedic Tissue Engineering, Marcel Dekker, New York, Chap. 1.

[18]Habraken, W., J. G. C. Wolke, and J. A. Jansen, 2007. Ceramic composites as matrices and scaffolds for drugdelivery in tissue engineering. Advanced drug delivery reviews,. 59(4): p. 234-248.

[19]Haghighat A, Hekmatian E, Abdinian M, Sadeghkhani E.2011. Radiographic Evaluation of Bone Formation and Density Changes after Mandibular Third Molar Extraction: A 6 Month Follow up.Dent Res J; 8:1–5. [PMC free article][PubMed]

[20]Hollister, S. J. 2005. Porous scaffold design for tissue engineering. Nature materials, 4(7): p. 518-524.

[21]Hong SR, Lee SJ, Shim JW, Choi YS, Lee YM, Song KW, et al. 2001. Study on gelatin-containingartificial skin IV: A comparative study on theeffect of antibiotic and EGF on cell proliferationduring epidermal healing. Biomaterials; 22(20): 2777-83

[22]Huang Y, Onyeri S, Siewe M, Moshfeghian A,Madihally SV. 2005. In vitro characterization ofchitosan-gelatin scaffolds for tissue engineering.Biomaterials; 26(36): 7616-27.

[23]Kim KM, Evans GRD. 2005. Tissue Engineering: The Future of Stem Cells. In: Ashammakhi N, Reis RL, editors. Topics in tissue engineering.

[24]Kyunghee Lee, Hyunsoo Kim, Jin-Man Kim, Jae-Ryong Kim, Keuk-Jun Kim,Yong-Jin, Se-Il Park, Jae-Ho Jeong, Young-mi Moon, Hyun-Sook Lim, Dong-Won Bae, Joseph Kwon, Chang-Yong Ko, Han-Sung Kim, Hong-In Shin, DaewonJeong.(2011), Systemic transplantation of human adipose-derived stem cells stimulates bone repair by promoting osteoblas and osteoclast function,Journal of Cellular and Molecular Medicine,J. Cell. Mol. Med. Vol 15, No 10, 2011

[25]Liao D, Gong P, Li X, Tan Z, Yuan Q. 2010. Co-culture with Schwann cells is an effective way for adipose-derived stemcells neural transdifferentiation. Arch Med Sci.; 6(2): 145-51.

[26]Liu B1,Cui L,Liu GP,Cao YL,Zhu JT,Cao Y. )2009(,Tissue-engineering bone with ADSCs and coral scaffold for repairing of cranial bone defect in canine.Zhonghua Zheng Xing Wai KeZaZhi.2009. May;25(3):204-8.

[27]Nather A, David V, Teng JW, Lee CW, Pereira BP. 2010. Effect of autologous mesenchymal stem cells on biological healing of allografts in critical-sized tibial defects simulated in adult rabbits. Ann Acad Med Singapore. Aug;39(8):599-606.

[28]Nichol JW, Khademhosseini A. 2009. Modular Tissue Engineering: EngineeringBiological Tissues from the Bottom Up. Soft Matter;5(7):13129.

[29]Olszta, M. J., Olszta, M. J., Cheng, X., Jee, S. S., Kumar, R., Kim, Y. Y., Kaufman, M. J., Douglas,. P., Gower, L. B., 2007. Bone structure and formation: A new perspective. Materials Scienceand Engineering: R: Reports,. 58(3): p. 77-116.

[30]Schliephake H, Zghoul N, Jager V, van Griensven M, Zeichen J, Gelinsky M, et al. 2009. Bone formation in trabecular bone cell seeded scaffolds used for reconstruction of the rat mandible.Int J Oral Maxillofac Surg.;38:166–72.[PubMed]

[31]Stockmann, Ph. Park, J. Wilmowsky, v. Nkenke, C. Felszeghy, E. Friedrich, J. et al. 2012 .Guided bone regeneration in pig calvarial bone defects using autologous mesenchymal stem/progenitor cells e A comparison of different tissue sources. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery,  40; 310e320.

[32]Wilson, ADH., Hart, A., Brannstrom ,T., Wiberg ,M., Terenghi, G., 2003,Primary sensory neuronal rescue with systemicacetyl-L-carnitine following peripheral axotomy, A dose-response analysis, British Journal of PlasticSurgery, 56:732-739.

[33]Yoshimura H, Muneta T, Nimura A, Yokoyama A, Koga H, Sekiya I. 2007;Comparison of rat mesenchymal stem cellsderived from bone marrow, synovium, periosteum, adipose tissue, and muscle. Cell Tissue Res. 327(3): 449-62.