تاثیرزهر زنبور عسل بر بیان ژن VEGF Aبر سلول‌های سرطان پرومیلوسیتی (HL-60)

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

چکیده

مطالعات مختلف بر اثرات ضد سرطانی زهر زنبور عسل تأکید دارد. آنژیوژنزیاتشکیلرگ‌هایخونیجدیدکه برایتکوینجنینوبسیاری ازوقایعفیزیولوژیکیموردنیازاستدربسیاری ازشرایطپاتولوژیکنظیررشدتومورها نیز ضروری است. یکی از ژن‌های فعال در روند رگ‌زایی VEGF-A می‌باشد. در این پژوهش تاثیر زهر زنبور عسل بر بیان این ژن بررسی گردید. سلول‌های HL-60 در محیط کشت RPMI1640غنی شده با 10% FBS کشت داده شد. پس از 24 ساعت، سلول‌ها توسط زهر زنبور در غلظت‌های 2، 4، 8و10 میکروگرم بر میلی‌لیتر تیمار گردیدند. 48 ساعت پس از تیمار، RNA  تام استخراج و cDNA با استفاده از توالی ژن مورد نظر سنتز شد و محصولات سنتزشده توسط Real Time PCR جهت بررسی سطح بیان ژن VEGF-Aمورد ارزیابی قرار گرفت.نتایج بررسی آماری داده‌ها نشان داد که کاهش معنادار (05/0(P< در میزان بیان ژنVEGF-A تیمارشده با غلظت‌های 2، 4، 8 و10میکروگرم بر میلی‌لیتر زهر زنبور عسل نسبت به سلول‌های گروه کنترل دیده می‌شود به‌نحوی‌که بیشترین تغییرات کاهشی بیان ژن مربوط به غلظتµg/ml10 زهر زنبور بود.نتایج بیانگر کاهش بیان ژن VEGF-A، بیومارکر ویژه آنژیوژنز در نمونه‌های تحت تیمار با زهر زنبور عسل در مقایسه با گروه کنترل است.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Effect of Bee venom on VEGF-A expression in HL-60 cell line

چکیده [English]

Research indicates that bee venom has potent anti-inflammatory, anti-tumor and anticancer. Angiogenesis or new blood vessel formation, which is required for embryonic development and many physiological events, plays a crucial role in many pathological conditions such as tumor growth. One of the main genes which is involved in the process of angiogenesis is VEGF-A. In this in vitro study, the effects of Bee venom extract on VEGF-A expression were examined.
In this experimental study, HL-60  cells were grown in RPMI 1640 medium supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (FBS) and incubated at 37˚C with 5% CO2. After 24 h of cell culture, they were treated by the Bee venom at concentrations of 2, 4, 8 and 10 µg/ml. 48 hours after treatment, total RNA was extracted and cDNA was synthesized using the sequence of target gene. Finally, the synthesized products were analysed by Real Time PCR to determine the expression level of VEGF-A.
The results of data analysis showed the inhibitory effect of Bee venom in concentrations of 2, 4, 8 and 10 µg/ml on VEGF-A expression in HL-60  cells in comparison with control group, indicating the highest reduction of gen expression for the highest concentration of Bee venom (10 µg/ml).
Results indicated a decrease in the expression of VEGF-A, specific biomarker of angiogenesis, in the treated samples compared to the control group.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Bee venom
  • angiogenesis
  • VEGF-A
  • HL-60 cell line
  • cancer

امروزه با توجه به اثرات جانبی برخی داروهای شیمیایی، استفاده از فراورده‌های طبیعی با حداقل اثراتجانبی و تداخل‌دارویی‌موردتوجهقرارگرفته ‌است. در این میان زهر زنبور عسل از دیرباز دردرمانبیماری‌هایی‌ مثل آرتریت،روماتیسم،تومورهایسرطانی،بیماری‌هایپوستیوتسکیندردمورداستفادهبوده است[10].زهرزنبورحداقل حاوی18نوعترکیبفعالشاملانواعپپتید‌ها (ملیتین،آپامین، آدولاپین،پپتید(MCD ،آنزیم‌هاییمثلفسفولیپازA2 ، آمین‌های فعالبیولوژیک (مثلهیستامین،اپینفرین)واجزاغیرپپتیدیاستکهدارایتنوعیازخاصیتداروییمی‌باشند. زهر­زنبوردارایخاصیتضد­التهابیبودهکهیکیازویژگی‌هایداروهایضدالتهابیغیر‌استروئیدیاست[15-16]. پیشنهادکردندکهاثراتسمیزهرزنبورازطریقفعالیتملیتینبررویفسفولیپازA2صورت گرفتهوالحاقپپتیدلیزکنندهسلولیملیتینباگیرنده‌های هورمونیوژندرمانیمی‌تواندنوعیدرمانهدف‌مندومفید جهتدرمانانواعسرطان‌هاباشد. انواعسلول‌هایسرطانیمثل کلیه،ریه،کبد،پروستات،مثانهوسینههمانندسلول‌های لوکمیایی‌می‌توانندهدفملیتینباشند[18.19].

سرطانحادپرومیلوسیت،نوعیسرطانخونومغزاستخوان بودهکهدرنتیجهتجمعغیرطبیعیپرومیلوسیت‌هابهوجود می‌آیداینبیماریدراثریکجابجاییکروموزومیبینژن گیرندهآلفا
ترانسرتینوئیکاسید (RARα)رویکروموزوم شماره 17 به ژن PML (Promyelocyte Leukemia)،روی کروموزوم‌ شماره ‌15 ‌به‌صورت(q22;q12-21)t(15:17)به وجود آمده و پروتئین مرکبی تحت عنوان
PML-RARα به وجود می آورد[22]. رده سلولی HL-60 یک دودمان سرطان حاد پرومیلوسیتی بوده که در آزمایشگاه­های تحقیقاتی جهت انجام مطالعات روی سلول‌هایخونیکاربردوسیعیدارد[17].

اولینرگ‌هایخونیطیپدیده‌ای‌موسومبه واسکولوژنزبهشکلنوپدیدازسلول‌هایپیش‌ساز آندوتلیالباآرایشخاصبوجودمی‌آیندوبهتدریج شروعبهانتشار،توسعهوتشکیلشاخه‌هایجدید می‌کنند،کهبهآنآنژیوژنزاطلاقمی‌شود [21]. درافراد بالغ،تشکیلرگ‌هایخونیجدیدازرگ‌های ‌قبلی بهطوردقیقیکنترلمی‌شودورگزاییفقطدرشرایط فیزیولوژیکیخاصنظیربارداریوشرایطپاتولوژیکی ویژهنظیرترمیمزخم،رتینوپاتیدیابتیک، پزوریازیس، آرتریتروماتوییدویاسرطان‌هااتفاقمی‌افتد.ازآنجا کهآنژیوژنزدرپدیدههایپاتولوژیکنظیررشدومتاستاز تومورهایسرطانینقشمهمیایفامی‌کند،لذامی‌تواند هدفدرمان‌هایضدتومورینیزقرارگیرد[11].این فرآیندبهفعلوانفعالاتوسیعبین‌ سلول‌هاوملکول‌های مختلفیوابستهاستوتوسطپپتیدهاوفاکتورهایتعدیلکنندهمتنوعیکنترلمی‌شود. فاکتورهایمتعددی نظیرVEGF Vascular Endothelial Growth Factor))،(Fibroblast Growth Factor) FGF، PTGFPlatelelte-drived Growth Factor))،STAT3 (SingalTransducer andActivitatorof(Transcriptionدر این پدیده دخالت دارند[5].

یکیازعواملمؤثردر آنژیوژنز،فاکتوررشداندوتلیالعروقی (VEGF) می‌باشدکهازفاکتورهایاصلیدرروندجوانهزدنعروقخونی جدیدازبسترعروقیاولیهوفاکتورکلیدیدرسیستم سیگنال دهی است،VEGFهمودایمریاست­کهبهدو رسپتور با تمایل بالا شاملVEGFR1 وVEGFR2 متصل می‌شود و عملکردوابستهبهدوزبرایآنشناختهشده است[1]. درشرایطدرونتنیVEGF نفوذپذیریعروق راکهبرایشروعآنژیوژنزضروریاست،تنظیممی‌کند بههمیندلیلبهآنفاکتورنفوذ‌پذیری عروق(Vascular Permeability Factor)گفتهمی‌شودودراینموردچندینبرابرقوی‌ترازهیستامینعملمی‌کند[6]. درفرایندرگ‌زایی،کاهشفشاراکسیژن (hypoxia)بافتموردنظرازاهمیتفوق‌العاده‌ایبرخورداراست. یکی از کاربردی‌ترین استفاده‌هایtime PCRRealبررسیبیانژنهاستکهبااستفاده
ازروش‌هاییهمچون کمیتسنجینسبی
(Relative Quantitative) انجاممی‌شود. اینروشدرحالحاضریکیازدقیق‌ترینروش‌های بررسیتغییراتبیانژن‌هاست[9].

از انجا که بیشتر مطالعات بر خواص ضدسرطانی و ضدآپوپتوزی زهر زنبور عسل تاکید دارند. در مطالعه حاضر تاثیر زهر زنبور عسل بر بیان ژن VEGF-A به عنوان فاکتور محرک آنژیوژنز بر رده سلولی سرطان پرومیلوسیتی (HL-60) بررسی شد.

 

موادوروش‌ها

الف- تهیهمحلول زهر زنبور عسل

غلظت‌های مورد استفاده از زهر در این طرح تحقیقاتی 2،4، 8 و 10 mg/mlبودند. جهت تهیه 30 میلی‌لیتر محلول استوک زهر زنبور عسل، 30 میلی‌گرم از پودر خالص در 30 میلی‌لیتر PBS (فسفات بافرسالین) حل گردید. غلظت نهایی محلول زهر در 30 میلی‌لیتر pbs برابر با gµ30 می‌باشد. بدین ترتیب، جهت تهیه غلظت g/mlµ 2 محلول زهر، lµ20 از محلول استوک با9980میکرو‌لیتر pbs رقیق گردید و جهت ساختسایر غلظت‌هانیز ازهمین روش استفاده گردید.

 

ب- کشت سلول

رده سلول‌های سرطان پرومیلوسیتی انسانی
(HL-60) که سلول‌هایی نامیرا (immortal)، مدل و با منشأ انسانی هستند از بانک سلولی انستیتو پاستور تهران خریداری و درمحیط کشتRPMI1640 (Biosera)غنی شده با دهدرصدFetal Bovine Serum (Gibco)به‌همراه یک درصد آنتی‌بیوتیک‌های پنی‌سیلینواسترپتومایسین شرکت Sigma در انکوباتوربارطوبت 95 درصد و 5 درصد CO2کشت گردید. پس از دو بار پاساژ سلولی و تکثیر آن‌ها، 5 میلیون سلول در هر فلاسک فیلتردار T5 کشت گردید.

24 ساعت پس از کشت و اطمینان و بررسی از

نظر تراکم و عدم آلودگی باکتریایی به وسیله میکروسکوپ‌ معکوس با زهر زنبور عسل با غلضت‌‌های 2، 4، 8 و 10 میکروگرم بر میلی‌لیتر بر اساس غلظت مهاری 50%IC50= Inhibitory)(Concentrationزهر زنبور عسل تیمار شد. به‌منظور بررسی قابلیت حیات (viability)عکسبرداری برای 3 روز متوالی به‌وسیله دوربین دیجیتال Dinocaptre متصل به میکروسکوپاینورت (Germany, Ziess)و تهیه تصاویری با بزرگنمایی 200x انجام پذیرفت.

جهت انجام تست تریپان‌بلومحیط کشت تخلیه و سلول‌ها توسط (PBS) phosphate buffered saline شد. سپس سلول‌ها با نسبت یک به یک به‌وسیله تریپان‌بلو رنگ‌آمیزی و شمارش سلولی بر روی لام نئوبار به‌کمک میکروسکوپ نوری انجام شد.

 

ج- استخراج RNA:

استخراج RNA توسطtotal RNA purification kit شرکت Jena Bioscience ساخت آلمان پس از 24 ساعت از تیمار سلول‌های سرطانی مطابق پروتوکل 5 مرحله‌ای ضمیمه کیت انجام پذیرفت.جهت حذف آنزیم RNase که بر سطح پوست و کلیه وسایل موجود می‌باشد از DEPCE waterدر سطح محیط کار، تجهیزات، ابزار و دستکش‌ها استفاده شد. علاوه بر این از نوک سمپلرها و میکروتیوپ‌هایRNase free جهت بازدهی مثبت کار در مراحل مختلف استفاده گردید. سلول‌های هر فلاسک توسط توسط سانتریفوژ پلیت سلولی تخلیص شد. این سلول‌ها به یک میکروتیوپ RNase free انتقال یافت. سپس 300 میکرولیتر ایزوپروپانول به محلول سلولی لیز شده اضافه و میکروتیوپ ورتکس شد. ستون اسپین از جنس سیلیکاژل در تیوپ جمع‌آوری قرار گرفت و مخلوط ایزوپروپانول به‌همراه سلول‌های لیزشده به آن انتقال پیدا کرد و در g12000 به‌مدت 30 ثانیه سانتریفوژ گردید و محلول زیرین حذف شد. در ادامه700 میکرولیتر بافر شستشودهنده اولیه به ستون اسپین اضافه و مجدداً به‌مدت 30 ثانیه سانتریفوژ شده و محلول زیرین خارج گردید. در مرحله بعد به ستون اسپین700 میکرولیتر بافر شستشودهنده ثانویه اضافه و سانتریفوژ شد و محلول زیرین حذف شد. به‌منظور حذف اتانول اضافی یک بار دیگر سانترفوژ در g12000 به‌مدت یک دقیقه انجام گردید و اتانول مازاد از ستون اسپین حذف شد و نهایتاً ستون اسپین به میکروتیوپRNAase free جمع‌آوری RNA منتقل شد و 50 میکرولیتر بافر جمع‌آوری‌کننده به آن اضافه شد. سپس در دمای اتاق به‌مدت یک دقیقه انکوبه گردید و در نهایت در g12000 به‌مدت یک دقیقه سانتریفوژ گردید وRNA تام تخلیص شده در منهای 20 درجه سانتی‌گراد تا زمان سنتز cDNA نگه‌داری گردید.

د-بررسیمیزانRNAتام استخراج‌شدهبه‌منظور ارزیابی و سنجش

میزان RNA استخراج‌شده، 2 میکرولیتر از بافر تخلیص به‌همراه RNA استخراج‌شده توسط دستگاه نانودراپ در طول موج‌های 260، 280 و 320 نانومتر سنجش و آنالیز گردید. از این داده‌ها که معرف میزان غلظت RNAاستخراج‌شده می‌باشد در سنتز cDNA استفاده شد:

100×40(320OD-260OD)= غلظت RNA

 

ه- سنتزcDNA

سنتز cDNAتوسط کیتAccu Power Racket ScriptTM RT Pre Mix (Korea) و پروتوکل ضمیمه کیت انجام شد. عملیات سنتز تحت شرایط دمایی مطابق جدول 1 انجام شد.و- سنتز پرایمرهاتوالی ژن‌های یادشده در سایت NCBI چک شد و توالی پرایمر در BLASTGENE تأیید و توسط شرکت کره‌ای Bioneer طراحی شد. پرایمرها مطابق جدول 2 طراحی شد.

 

 

جدول 1- برنامه دمایی مورد نیاز برای سنتز cDNA

Time

Temperature

Step

1  Min

Tm of specific primer

Primer annealing

60-10 Min

C70-42

cDNA synthesis

5Min

C95

Heat inactivation

 

جدول 2- توالی ژن‌های مورد بررسی

Reverse 5'→3'

Forward 5'→3'

Gene

CAC ACA GGA TGG CTT GAA G

CCT GCC TTG CTG CTC TAC C

Vascular Endothelial Growth Factor A

AAG GTC TCA AAC ATG ATC TGG GTC

CCC GCC GCC AGC TCA CCA TGG

Β.actin

 


ز- بررسی بیان ژن با استفاده از Real Time PCR

مراحل انجام real time PCR به‌منظور بررسی بیان ژن مورد بررسی به‌وسیله کیتBioneer ساخت کره جنوبی و به نام تجاری Accu Power 2X Greenstar qPCR Master Mix مطابق پروتوکل 6 مرحله‌ای ضمیمه توسط دستگاه Applied Biosystems بررسی شد. براساس پروتوکل ابتدا Master Mix مواد تهیه و به میکروتیوپ‌های strip cap مخصوص دستگاه منتقل شد و در نهایت cDNA به آن اضافه گردید. برنامه دمایی براساس Tm پرایمرهای طراحی‌شده و منطبق بر ویژگی‌های مراحل مختلف واکنش‌های زنجیره‌ای پلیمراز تعیین شد.سطح بیان ژن VEGF-A در نمونه‌های تحت تیمار با زهر زنبور عسل در مقایسه با نمونه کنترل توسط نرم‌افزار آماری SPSS 16 تحلیل شد. در آزمون فیشر 05/0P< و فاصله اطمینان 95 درصد(Confidence Interval)به‌عنوان معناداری پذیرفته شد. پس از اتمام PCR خط آستانه توسط نرم‌افزار دستگاه Applied Biosystem تعیین گردید. تحلیل اطلاعات برای تعیین بازدهی ژن هدف پس از تهیه رقت‌های متوالی از ژن خانه‌دارHouse Keeping) (Gene به‌منظور تهیه نمودار استاندارد Ct انجام پذیرفت. میزان بیان ژن VEGF-A پس از 48 ساعت از انکوباسیون سلول‌ها به‌وسیله غلظت‌های مختلف زهر زنبور عسل اندازه‌گیری شد. میزان بیان ژن مورد نظر با نمونه کنترل بدون تأثیر عصاره مذکور مورد مقایسه قرار گرفت.در این پژوهش آزمایشگاهی از کمیت‌سنجی نسبی (Relative Quantitative)که اساس آن بر مبنای نسبت بیان ژن هدف به ژن مرجع استوار است استفاده گردید که از طریق مقایسه کارایی (efficiency)ژن هدف به نمونه کنترل و اختلاف Ct می‌باشد. مقدار پرایمر و دمای مرحله اتصال پرایمر فاکتورهای اساسی در بهینه کردن واکنشReal Time PCRهستند. شرایط بهینه طوری فراهم گردید که بازدهی واکنش در بهترین حالت ممکن بوده و هیچ محصول غیراختصاصی در طول واکنش تولید نشود. این امر با استفاده از منحنی ذوب از طریق یک پیک منفرد قابل تأیید می‌باشد.

 

یافته‌ها

نتایج تست تریپان بلو زنده بودن 95 درصد سلول‌های تحت بررسی را مشخص کرد و از این سلول‌ها در بخش‌های مختلف کار استفاده شد. منحنی تکثیر (amplification plot)تحت تیمار مختلف با زهر زنبور عسل رسم شد (نمودار 1). نتایج بررسی سلول‌های تیمارشده تحتاثرزهر زنبور، تفاوت‌های بسیار بارز و وابسته به غلظت را نشان داد به‌طوری‌کهبه‌تدریجدر دوزهایبالاترتغییرات به صورت کمشدن تراکم سلولی، قطعه قطعه شدن هسته، مهاررشدسلول‌هاو تحلیل‌رفتگی سلولیقابل مشاهدهبود. از سوی دیگر با توجه به این‌که بازدهی واکنش PCR بین ژن هدف و ژن خانه‌دار(House Keeping Gene) مورد استفاده یعنی بتا اکتین یکسان بود، از مقایسه چرخه آستانه (CT) استفاده شد. در روش مقایسه چرخه آستانه در Real Time PCR مبتنی بر تغییرات چرخه آستانه نمونه‌های تحت تیمار با نمونه کنترل است که به کمک آن نسبت افزایشی یا کاهشی بیان ژن در مقایسه با نمونه کنترل (فاقد تیمار) مشخص می‌شود. نتایج بررسی‌های بیان ژنی نشان داد که کاهش معنادار در میزان بیان ژنVEGF-A تیمارشده با غلظت‌های 2، 4، 8و10 میکروگرم بر میلی‌لیتر نسبت به سلول‌های گروه کنترل دیده می‌شود به‌نحوی که بیشترین تغییرات کاهشی بیان ژن مربوط به بیشترین غلظت زهر زنبور عسل بود.

 

 

نمودار1 -  منحنی تکثیر Real Time PCRمربوط به بیان ژنVEGF-A در نمونه کنترل در مقایسه با نمونه های تحت تیمار با زهر زنبور عسل

 

 

نمودار2) بررسی میزان بیان ژنVEGF A پس از نرمالایز کردن نسبت به ژن بتا اکتین

 

 


بحث

دستیابیبهروش‌هایپیش‌گیریودرمانسرطان‌هاو نیزشناساییمکانیسم‌هایدخیلدرروندپیشرفتآنهاباتوجهبهگسترشایندستهازبیماری‌هادرسال‌های اخیرتوسعهچشمگیرییافتهاست.نتایجتحقیقاتمختلفنشانمی‌دهدبازگشتمجددبهفراورده‌های طبیعیدرکناراستفادهازداروهایسنتتیکمی‌تواندرویکردمثبتیدرخصوصکنترلودرمانطیفگسترده‌ایازبیماری‌ها ازجملهسرطان‌هاباشد[7].ازآنجاکهاستفادهاززهر زنبور عسلوترکیباتمؤثرهآنمثلملیتینبهعنواندارویی باویژگی‌هایضدسرطانیپیشتربهاثباترسیدهاستوباتوجهبه اینکهتاکنونمقاله‌ایدرخصوصویژگی آنتی‌آنژیوژنیکزهر زنبور عسل بر روی رده سلولی HL-60مطرحنشدهاست. نویسندگانمقالهبهبررسیمکانیسم‌هایاحتمالیآناز طریقبررسیمیزانبیانژن) VEGF A بهعنوانبیومارکر ویژهرگزایی) درنمونهتحتتیماربازهر زنبور عسلبانمونهکنترلدرسلول‌هایسرطانپرومیلوسیتیانسان بهعنوانمدلمطالعهپرداختند.

نتایجبهدستآمدهدرتحقیقحاضرنشاندادکهاستفادهاززهر زنبور عسلدردوزهاییادشدهدرنمونه‌هایتیمارشدهVEGF A منجربهکاهشبیانژننسبتبهنمونهشاهدمی‌شود.اینکاهشبیانژندرغلظت‌های2و4میکرو‌گرمبرمیلیلیترنسبتبهگروهکنترلمعناداربودگرچهکاهشبیانژندرایندوغلظتنسبتبهیکدیگرتفاوتچشمگیرینشاننداد. درغلظت10میکروگرمبرمیلی‌لیتر )بالاترینغلظتمورداستفاده (حداکثرکاهشبیانژندیدهشد.

Jang وهمکارانگزارشکردندکه زهر زنبور عسل قادربهالقاءآپوپتوز و مهاربیانسیکلواکسیژناز2 (COX- 2: cyclooxygenase 2 )درردهسلولیسرطانریهانسانی NCI-H 1299می‌باشد و آنهانشاندادندکهغلظت مشخصیاز زهر زنبور عسل قادربهقطعهقطعهکردنDNA  بهدنبالفعالشدن اندونوکلئازها، القاءتغییراتمورفولوژیکیمرتبطباآپوپتوزمانندتشکیل اجسامآپوپتیک، افزایشبیان Baxو کاسپاز3 وکاهش بیان Bcl-2، مهار انتخابیبیان 2COX- و کاهش تولید پروستاگلاندین‌ها
PGs:Prostaglandins)) می‌باشد، COXs آنزیم‌هایکلیدیدرسنتز PGSهستند[8].

برخی مطالعات نشان داد که زهر زنبور عسل باعث کاهش بیان VEGF-A در رده‌ی سلولی LLC سرطان ریهو سلول‌های اندوتلیال سیاهرگ بند نافی انسان (HUVECs)می‌شود[3].

همچنین در گزارشی بیان شد که تغییرات مورفولوژیکی اینگونه به نظر می­رساند که در سطح مولکولی زهر زنبور عسل سنتز اسید نوکلئیک را مهار می­کند. سلول‌هاقبلازتیماربازهرزنبوربهصورتسالمویکپارچهباهستهکاملاطبیعیظاهرشدند. دراینسلول‌هاپسازتیمارباغلظت‌هایبالاتر،سیتوپلاسمبهصورتحبابدارشدهوهستهبهصورتمتراکموقطعهقطعهمشاهدهشد[13].

Hamedani بررسی کرد که زهر زنبور عسل در غلظت 5/0-0 میکروگرم بر میلی لیتر باعث تحریک MMP-2 و MMP-9 و در غلظت‌های بیشتر از 5/0 میکروگرم بر میلی لیتر باعث مهار این دو می‌شود .[4]

ازآنجاکهدرتحقیقحاضرزهر زنبور عسل منجربهکاهشبیانژن VEGF-A بهعنوانیکیازمارکرهایمهممسیرسیگنالینگآنژیوژنزمی‌شد.بهنظرمی‌رسدنتایجهمراستابانتایجتحقیقاتمتعدددرارتباطباسایتوتوکسیسیتهوآثارضدسرطانیزهر زنبور عسلاست.مکانیسم پیشنهادی احتمالی برای پژوهش حاضر را اینگونه می­توان بیان کرد که، زهر زنبور عسل می‌تواند باعث غیر فعال کردن کالمودولین در سلول شود در حالیکه اتصال کلسیم کالمودولین باعث فعال شدن (Hypoxia-inducible factor1)HIF-1 شده و در نتیجه باعث القای بیان فاکتورهای پیش آنژیوژنزی مثل VEGF میشود. پس غیر فعال کردن کالمودولین می‌تواند باعث مهار آنژیوژنز شود[14]. هم چنین تحقیقات پیشنهاد می‌کنند که فعالیت‌های ضد آنژیوژنزی زهر زنبورعسل در طی مراحل مختلف پیشرفت تومور با بلوکه کردن فسفریلاسیون  VEGFR-2دیده می‌شوند[3].

ازآنجااغلبسرطان‌هایانسانیدرنتیجهنقصدرارتباطاتبیوشیمیاییوبیولوژیکیدرسطحملکولیسلولایجادمی‌شودوازطرفیاطلاعاتبسیارکمیدربارهمکانیسم‌هایکنترلکنندهرشدسلول‌هاوجودداردبهنظرمی‌رسدانجامآزمایشاتدقیقباهدفشناساییمکانیسم‌هاومسیرهایملکولیسرطان‌هاضروریباشد[2]. گروهژنیخانواده VEGFخانواده ی بزرگیازژن‌هایوابستهبهیکدیگرهستندکهدربسیاریازمسیرهایتمایزیهمچونرشدوانشعابآلوئول‌هایتنفسیوجوانه‌هایمیزناییکلیهاثردارند.ضمناًاعضای اینخانوادهنقش‌هایتحریکیمتنوعیبهویژهVEGF-A ، نقش‌های تحریکی متنوعی رادرسلولسرطانیبرعهدهدارند؛پاسخ‌هایسلولینظیرتکثیر،مهاجرتوبیانپروتئین‌هایآنتی‌آپوپتوزی‌ ازجملهفعالیت‌هایناشیازاینژن‌هامی‌باشد.علاوهبراین،فعالیتایندستهازژن‌هامنجربهفعال‌سازی ‌دستهدیگریازژن‌هامی‌گرددکهازطریقآبشارراهاندازیشدهمذکور،سلولسرطانیراقادرمی‌سازدتارگ‌هایعملکردیخون‌رسانرابهسویخودجلبکردهوبهتبعآنتغذیهواکسیژنرسانیورشدوتکثیرسلول­هایتوموریامکان­پذیرمی‌گردد[20].بهتریناستراتژیمهار لیگاندهای VEGFاستو می‌تواندبهعنوانهدفدرمانیمؤثربرایدرمانبسیاریازبدخیمی‌هایشایع‌ موردتوجهقرارگیرد.[12] کاهشبیانایندستهازژن‌هادرسلول‌هایسرطانیکشتشدهدرشرایطبرون‌تنیتحتتیماربازهر زنبور عسل،می‌تواندبخشیازپتانسیلضدسرطانیاینفرآوردهراازخلالمسیرهایضدرگزایینشان‌ دهد. لذامی‌تواننتیجهگرفتکهاحتمالاًعملکردزهر زنبور عسل در خصوصویژگی‌هایضدسرطانیباکاهشآنژیوژنزنیزمی‌تواندمرتبطباشد.

 

نتیجه‌گیری

نتایجمطالعهحاضربیانگراثراتکاهشدهنده آنژیوژنزیزهر زنبور عسلازطریقاثرکاهشبربیان ژنVEGF-A می‌باشدکهمی‌تواندکمکیبهدرکاثرات ضدتوموریوآثارضدسرطانیاینفرآروده طبیعیباشد، هرچندمطالعاتبیشتروپژوهش‌های ‌بالینیبرایدرک چگونگیعملکردوشناساییترکیباتمؤثردرروند کاهشبیاناینژنضروریاست.

 

[1]    Breier G. Vasculogenesis. In: Unsicker K, Kriegistein K. 2006. Cell signaling and growth factors in development.Weinheim: Willey & Wang; 909-17.

[2]    Cristofanilli M, Broglio KR, Guarneri V, Jackson S, Fritsche HA, Islam R, et al. 2007.Circulating tumor cells inmetastatic breast cancer biology staging beyond tumor burden. Clin Breast Cancer; 7(6): 471-9.

[3]    Eun Huh J, HyeonBaek Y, Ho Lee M, Young D and etal.2010. Bee venom inhibitstumor angiogenesis and metastasis by inhibiting tyrosine phosphorylation ofVEGFR-2 in LLC-tumor-bearing mice; Cancer Letters; 292(1): 98–110.

[4]    Hamedani M, MirshafieyA, Vatanpour H, Khorramizadeh MR, et al. 2005. In vitroassessment of Bee Venom effects on Matrix Metelloproteinase Activity andInterferon Production. Iranian Journal of Allergy, Asthma and Immunology;27(4): 1-6.

[5]    Hendrix M, Seftor E, Seftor R. 2006.Vasculogenic mimicry: angiogenesis in disguise. New Frontiers inAngiogenesis; 5: 97-109.

[6]    Hoeben A, Landuyt B, Highley MS, Wildiers H, Van Oosterom AT, De Bruijn EA. 2004.Vascularendothelialgrowth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev; 56(4): 549-80.

[7]    Hoshyar R, Bathaie SZ, Sadeghizadeh M. 2013. Crocin triggers the apoptosis through increasing the Bax/Bcl-2 ratioand caspase activation in human gastric adenocarcinoma, AGS, cells. DNA Cell Biol; 32(2): 50-7.

[8]    Jang MH, Shin MC, Sabina LS, Han SM, et al. 2003. Bee venom induces apoptosis andinhibits expression of cyclooxygenase-2 mRNA in human lung cancer cell lineCIH1299.Pharmacology Science; 91: 95 –104.

[9]    Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Analysis of relative gene expression data using real time quantitative PCR and the2ΔCCT methods. Methods; 25(4): 402-408.

[10]. Mansouri K, mostafaei A, mohammadimotlagh HR. 2010.Angiogenesis and tumor. Behbood Journal; 14(4) 305-315.

[11]Mostafaie A, MohammadiMotlagh H, Mansori K. 2009. Angiogenesis and the models to study angiogenesis. J Yakhteh Med; 11(4): 381-79.

[12]Mousavi M, Baharara J, Zafar- BalanejadS and Shahrokhabadi K.2014. effect of Saffaron extract on VEGF-Aexpression in MCF7. Journal of Ker,anshah University of medical sciences; 17(12):55-58.

[13]Nabiuni M, Pariva K, Divsalar A, Safayinejad Z, Nazari Z. 2012. A review onantineoplastic effects of honey bee venom. Zahedan J Res Med Sci (ZJRMS). 13(9): 1-7.

[14]Oršolić N. 2012. Bee venom in cancer therapy. Cancer Metastasis Rev; 31(2):173-194.20.

[15]Park HJ, Lee SH, Son DJ, Oh KW, et al. 2004.Antiarthritic effect of bee venom: inhibition of Inflammation mediator generation by suppression ofNF-kappaB through interaction with the p50 subunit Arthiritis and Rheumatism; 50: 3504-3515.

[16]Peiren N, Vanrobaeys F, Graf DC, Devreese B, etal. 2005. The protein composition of honey bee venomreconsidered by a proteomic approach. BiochemicalBiophysical; 1752:1-5.

[17]Ratanachoo K, Gascoyne PRC, Ruchirawat M. 2002. Detection of cellular responses to toxicants bydielectrophoresis. . BiochimBiophys Acta;1564 (2): 449–458.

[18]Son DJ, Ha SJ, Song HS, Lim Y, et al .2006. Melittininhibits vascular smooth muscle cell proliferationthrough induction of apoptosis via suppression ofnuclear factor-κB and Akt activation andenhancement of apoptotic protein expression.Pharmacology and Experimental Therapeutics; 317(2): 627-34.

[19]Terra RM, Guimaraes JA, Verli H. 2007. Structural andfunctional behavior of biologically active monomeric melittin. Molecular graphics andmodeling; 25(6): 767-72.

[20]Tugues S, Koch S, Gualandi L, Li X. 2011.Vascular endothelial growth factor and receptor: anti angiogenictherapyin treatment of cancer. Molecular Aspects of Medicine; 32: 88-111.

[21]Wu Y, Hooper AT, Zhong Z, Witte L, Bohlen P, Rafii S, et al. 2006. The vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR-1) supports growth and survival of human breast carcinoma. Int J Cancer; 119(7): 1519-29.

[22]Zelent A, Guidez F, Melnick A, Waxman S, etal. 2001. Translocations of the RARa gene in acutepromyelocytic leukemia. Oncogene; 20:7186 –7203.