نوع مقاله: مقاله پژوهشی
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
In recent decades, several researches have been done on plants in order to evaluate the expression of genes influenced by blue and red light. The aim of present study is analyzing the effects of blue and red light on the expression of CRY1 and HY5 genes in rape seedlings. These seedlings were placed in steady environmental conditions and then in blue light treatment (2, 4 or 8 hr) and in red light treatment (2, 4 or 8 hr) for 5 days, and the variation of hypocotyl length in various treatments was scrutinized and the expression level of CRY1 gene was analyzed by Semi-quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technique. Also, the amount of HY5 gene expression along with CRY1 gene expression was examined by Quantitative Real-time-Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) technique. Results of studying the effects of blue light treatment on control and treated plants showed that the blue light is capable to adjust expressing CRY1 gene and thus to control photomorphogenesis in rape (Brassica napus L.) plants, so that in an 8-hour treatment with blue light, we observed the highest level of CRY1 expression. Of course, the expression level of HY5 gene reached to its highest point, which resulted in maximum inhibition of hypocotyl elongation in this special group.
کلیدواژه‌ها [English]
نور نه تنها منبعی از انرژی، برای فتوسنتز گیاهان سبز محسوب میشود، بلکه منبع غنی از اطلاعات، برای فتوپریودیسم (گیاهان قادر به درک طول شب/ طول روز هستند)، فتوتروپیسم (گیاهان قادر به درک جهت نور هستند) و فتومورفوژنز (گیاهان قادر به درک کمیت و کیفیت نور هستند) محسوب میگردد.
نور همچنین، مهمترین عامل محرک در نمو گیاهان
است، گیاهان برای پیشبرد مسیر تکاملی خود، نیاز به درک شدت، جهت و کیفیت (طول موج) نور دارند، که برای نایل آمدن به این مهم، گیاهان دارای گیرندههای بسیار تخصص یافته شدهاند [6].
نور به چهار محدودة طول موجی پایهای برای گیاهان تقسیم میشود و این چهار محدوده طول موج اصلی، قادر به ارسال پیامهای کنترل کننده در طی فرآیندهای رشد و نمو گیاهان هستند که این چهار محدوده اصلی عبارتند از: 1- محدوده نور فرابنفش (از 340 تا 400 نانومتر)، 2- محدوده نور آبی (از 400 تا 500 نانومتر)، 3- محدوده نور قرمز (از 600 تا 700 نانومتر)، 4- محدوده نور مادون قرمز (از 700 تا 800 نانومتر). البته در گیاهان برای جذب این چهار محدوده اصلی طول موجی، سه گروه گیرنده اختصاصی وجود دارد که شامل: 1- کریپتوکروم (جاذب نور آبی و فرابنفش)، 2- فتوتروپین (جاذب نور آبی و فرابنفش)، 3- فیتوکروم (جاذب نور قرمز و مادون قرمز) هستند [2و11].
نور محیطی گیاه، اگر توسط گیرندههای خاصی جذب شود سبب یک سیر تکاملی در حال گذر از حالت ریختزایی تاریکی[1] به سمت ریختزایی نوری[2] دانهرستهای رشد یافته در تاریکی
(dark-adapted)، دارای ریختزایی تاریکی هستند که این دانهرستها دارای فنوتیپ کوتیلدونهای بسته، ریشه های کوتاه و هیپوکوتیلهای بلند هستند، در حالی که بر عکس دانه رستهای رشد یافته در معرض نور دارای تکامل از نوع light-adapted هستند که به علت القا بیان ژنهایی که توسط نور تحریک میشوند، دارای فنوتیپ کوتیلدونهای گسترده، فتوسنتز بالا، سرکوب طویل شدگی هیپوکوتیل و ریشه‌های بلند هستند [35].
در واقع نور سبب تسهیل این گذار تکاملی از ریختزایی تاریکی به ریختزایی نوری توسط حسگرهای گیرنده نور که بسیار تخصصی از یکدیگر عمل میکنند و قادر به جذب طول موجهای خاصی در محدوده عمل خود هستند، می شود [1،17،18].
مطالعات بر روی جهشیافتههای گیرنده نور آبی، مشخص کرد که ژن کریپتوکروم 1، جزء اولین فاکتورهای اولیه درگیر در تنظیم پاسخهای ریختزایی نوری از جمله منع طویل شدن هیپوکوتیل، تجمع آنتوسیانین، گسترش برگ و کوتیلدون است در حالی که کریپتوکروم 2، نقش مهمی در تنظیم زمان گل دهی، منع رشد هیپوکوتیل، گسترش کوتیلدون در شدت‌های پایین نورهای آبی دارد[40].
ر این میان، کریپتوکروم 1 با سرکوب فاکتورهای رونویسی نظیر HY5/HYH و یا HFR1 از طریق COP1/SPA1، وارد عمل شده و در نتیجه سبب مهار رشد هیپوکوتیل میگردد [10،29،39]، همچنین فاکتور رونویسی LONG HYPOCOTYL 5
(HY5) نقش مهمی در بیان ژن‌های تحریک شده، توسط نور بازی میکنند به طوری که دیده شده جهش یافتهhy5 ویژگی های یک دانه رست رشد یافته در تاریکی را در حضور نور از خود به نمایش می‌گذارد، به این معنی که این جهشیافتهها، دیگر قادر به منع کردن از طویل شدن هیپوکوتیل نیستند[14،30].
از آن جا که در روشنایی و در طی فرآیند ریختزایی نوری، سطح بیان ژن HY5 بالا است و در نتیجه منع کردن از بلند شدن هیپوکوتیل نیز بالا است اما در تاریکی سطح بیان ژن HY5 پایین است و منع کردن از بلند شدن هیپوکوتیل نیز پایین و نتیجه داشتن هیپوکوتیلهای بلند، در تاریکی است [13].
با مشخص شدن خصوصیات گیرنده کریپتوکرومها (Cryptochromes) در گونههای گیاهی پیشرفته از قبیل: برنج، گوجهفرنگی، نخود و کلزا (Brassica)، محققین توانستند راه جدیدی برای به کارگیری از گیرنده کریپتوکرومها به نفع و پیشرفت غلات و محصولات کشاورزی مهم، قدمی بلند بردارند چرا که توسط کنترل ژن تولید گیرنده کریپتوکروم، میتوان ارتفاع گیاه و کنترل زمان گلدهی را تحت کنترل محققین، قرار داد [17،18].
در غلات مهم از نظر کشاورزی، کوتولگی (dwarfism)، نقش حیاتی در برابر مقابله باwater louding و در نتیجه داشتن حجم بالای برداشت محصول دارد [19] و همانطور که میدانیم گیاه کلزا ((Brassica napus، یک گیاه دانه روغنی[3] مهم است که بسیار بلند بوده، که آن را بیشتر حساس به از دست دادن دانه در گیاه مرتفع در حین برداشت مکانیکی میکند، از این رو میتوان با کنترل بر بیان ژن کریپتوکروم1 به گیاهان کوتاه تری دست یافت [26].
ژن CRY1 سبب کنترل طول هیپوکتیل و ریشه اولیه در (B.napus) میگردد که این عمل از طریق ایجاد تغییر در بیان ژن HY5 که خود فاکتور رونویسی است و سبب خاموش و روشن شدن بسیاری از ژن‌های دیگر متأثر از نور میگردد، صورت می پذیرد [27].
نتایج بررسی حال حاضر نشان داد که ژن کریپتوکروم1 سبب تنظیم رشد و نمو طول هیپوکوتیل دانهرست های(Brassica napus L. )از طریق ایجاد تغییر در بیان فاکتور رونویسی HY5 میگردد.
مواد و روش‌ها
کلزا با نام علمی (Brassica napus L.)، گیاهی دولپه و دانه روغنی از تیره چلیپاییان بوده و دارای ارزش تغذیهای است. بذرهای تهیه شده از مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان خراسان (بخش دانههای روغنی)، رقم بذرهای کلزا پاییزه (Modena)، مقاوم به سرما، به مدت 10 دقیقه در محلول 10% هیپوکلریت سدیم ضدعفونی شده ،سپس در پتری دیشهای استریل حاوی کاغذ صافی استریل گذاشته شدند و دانه رستها در اتاق کشت با دوره نوری 14 ساعت روشنایی و 10 ساعت تاریکی به مدت 5 روز رشد یافتند، سپس دانهرستهای شاهد، همین رژیم نوری تاریکی و روشنایی را ادامه دادند و دانهرستهای تحت تیمار نور آبی(2 ساعت، 4 ساعت، 8 ساعت) و تحت نور قرمز (2 ساعت، 4 ساعت و 8 ساعت) قرارگرفتند، همچنین منبع نورهای آبی و قرمز دارای صفحهای به ابعاد 120×120 سانتی متر و حاوی لامپ (LED)light-emitting dioded با شدت نور خروجی 750 لوکس از فاصله cm50 اعمال شدند. این آزمایشها در 7 گروه و برای هر گروه 12 بذر کشت شد (در 3 تکرار)، برای هر گروه تیمار نور آبی و قرمز به طور مجزا اعمال شد و اندازهگیری طول هیپوکوتیل بررسی شد.
استخراج Total RNA
بعد از برداشت نمونه (دانهرست) و توزین آن، نمونهها در هاون چینی توسط ازت مایع، کاملاً پودر شد و RNA ها توسط کیت RNeasy Plant Mini Kit محصول شرکت کیاژن و از نمونه‌های شاهد (رشد یافته با نور طبیعی محیط) و سپس از نمونه‌های (2 ساعت، 4 ساعت، 8 ساعت) تیمار با نور آبی و (2 ساعت، 4 ساعت، 8 ساعت) تیمار با نور قرمز در حد دانهرست، استخراج RNA ،جهت بررسی میزان بیان ژن کریپتوکروم 1 و HY5 انجام شد و سریعاً به cDNA تبدیل و در ازت مایع نگهداری شدند. میزان cDNA های مربوط به تیمارهای مختلف توسط نانو دراپ مشخص شد (جدول 1) و پس از حاصل کردن اطمینان از وجود cDNA و میزان آن RT-PCR و Real time PCR انجام شد.
جدول1: نانودراپ cDNA های گروه شاهد و تیمارهای مختلف
از آن جا که برای مقایسه بیان ژن اختصاصی در نمونههایی با تیمارهای مختلف، نیاز به یک ژن همیشه بیان (House Keeping gene) در نمونه‌های مورد بررسی بود کهHouse Keeping gene مورد استفاده در این بررسی -actinβ بود که برای بسیاری از گیاهان دولپه طراحی شده و طول قطعهای برابر با bp 101 دارد که توالی پرایمرها عبارت بودند از:
واکنش RT-PCR برای ژن BnCRY1
ژن BnCRY1با Accession nom: AJ 344565 با دارا داشتن منطقهای bp4349 در موقعیت مکانی 269/2 تا bp 274/2 در سطح DNA میباشد و در سطح cDNA با پرایمرهای اختصاصی، دارای طول قطعهbp 760، میباشد. پرایمرها برای ژن اختصاصی BnCRY1 و β-Actin به شرکت آرین ژن گستر سفارش داده شد و توالی این پرایمرها عبارت بودند از:
|
BnCRY1 |
Name |
|
GTG.GAG.AAA.GGA.ACG.AGG.TTG.TGG.CAC.TG |
Forward Primer sequence 5’-3’ |
|
CAT.GAG.GCA.CTC.TCG.CAG.ATG.TGG.CAA.C |
Reverce Primer sequence 5’-3’ |
|
β -Actin |
Name |
|
GCT.TCC.CGA.TCA.AGT.CA |
Forward Primer sequence 5’-3’ |
|
GGA.TTC.CAG.CTG.CTT.CCA.TTC |
Reverce Primer sequence 5’-3’ |
واکنش برای ژن BnCRY1 انجام و مقایسه بیان نیمه کمی آن با نرمافزار Kodak صورت گرفت.
واکنش Quantitative real time PCR برای ژن فاکتور رونویسی HY5
در این بررسی از master آماده SYBR Green که خود حاوی فلورسانت است و به محصولات cDNA اجازه میدهد تا دستگاه بتواند غلظت cDNA را به صورت کیفی در هر سیکل اندازهگیری نماید و در قالب نمودار، ارائه دهد.
در نمودارها، نمونههایی را به صورت رندوم
انتخاب و سپس cDNA این نمونهها را با یک دیگر مخلوط و به عنوان Standard curve تعریف و سپس هر یک از نمونهها cDNA مورد بررسی خود را (HY5)، با Standard curve مقایسه کرده تا میزان بیان ژن موردنظر(HY5) در مقایسه با منحنی استاندارد به صورت کمّی بیان شود.
برای بررسی بیان کمّی ژن HY5 با استفاده از روش SYBR Green، که SYBR Green از شرکت Takara با کد 420RR ، تهیه شد.
برای cDNAهای HY5 و Actin-β به طور مجزا qPCR، طبق برنامه زیر انجام شد:
|
˚95C |
30min |
45 cycle PCR amplification |
|
˚95C |
5 min |
|
|
˚60C |
30 min |
پس از انجام تکنیک، میتوان هر یک از نمودارهای داده شده از گروههای مختلف برای بررسی ژن HY5 و Actin-β را با Standard curve مقایسه کرده و برای آنالیز گروه کنترل و تیمار به روش ΔΔ CT، عمل شد.
روش‌های آماری تحقیق
تجزیه و تحلیل دادهها با استفاده از طرح تصادفی در سه تکرار توسط نرمافزار SPSS انجام گرفت. همچنین مقایسه میانگینها براساس آزمون ANOVA و تست Duncan صورت گرفت و رسم نمودارها به کمک نرمافزار Excel انجام شد.
نتایج
بررسی اثر نور قرمز و آبی بر طول هیپوکوتیل
با توجه به دادههای موجود در (جدول 2)، طول هیپوکوتیل دانهرستهای کلزا تحت تیمارهای مختلف نور قرمز، کاهش معنیداری را در مقایسه با گروه شاهد، نشان داد (شکل 2) که کمترین طول هیپوکوتیل مربوط به تیمار 8 ساعت نور قرمز بود. اعداد منفی شاخص پاسخ اثر بازدارندگی تیمارهای فوق را نشان میدهد. تأثیر نور آبی بر طول هیپوکوتیل متفاوت بود. به طوری که تیمار 2 ساعت نور آبی موجب افزایش طول هیپوکوتیل در مقایسه با گروه شاهد شد گرچه این افزایش از نظر آماری معنیدار نبود. تیمارهای 4 و 8 ساعت نور آبی موجب کاهش طول هیپوکوتیل شدند که این کاهش در مقایسه با شاهد و تیمار 2 ساعت نور آبی معنیدار، بود (جدول 2، شکل 1و2و3).
جدول2: اثر نور قرمز و آبی بر طول هیپوکوتیل و ریشه اولیه دانهرستهای کلزا
|
تیمارها |
طول هیپوکوتیل(cm) |
شاخص پاسخ |
|
شاهد |
a6/4 |
- |
|
نور قرمز (ساعت) |
|
|
|
2 4 8 |
b96/2 c7/1 d4/1 |
35- 63- 69- |
|
نورآبی (ساعت) |
|
|
|
2 4 8 |
a8/4 b3/2 d4/1 |
3/4 50- 69- |
وجود حداقل یک حرف مشترک در هر ستون نشان دهنده عدم وجود اختلاف معنیدار در سطح 05/0>p میباشد
شکل 1: مقایسه متوسط طول هیپوکوتیل دانه رست کلزا تحت نور آبی
شکل 2: مقایسه متوسط طول هیپوکوتیل دانه رست کلزا تحت نور قرمز
شکل 3: مقایسه متوسط طول هیپوکوتیل دانه رست گیاه کلزا در دو گروه تحت تیمار با نور قرمز و آبی با یکدیگر
میزان بیان ژن های کریپتوکروم1 و HY5 در دانهرستهای کلزا تحت تیمار نور قرمز و آبی
در الکتروفورز مربوط به ژن CRY1، ضخامت باندهای تشکیل شده، نشان دهنده میزان بیان ژن است. در این حالت به صورت کیفی، میزان بیان ژن را در تیمارهای مختلف مقایسه کرده(شکل 4و5) و برای بررسی دقیقتر میزان بیان ژن و بیان نتایج به صورت کمّی، از نرم افزار Kodak استفاده شد که این نرمافزار ضخامت باندهای مربوط به بیان ژن را به صورت عددی بیان میکند. با توجه به (شکل 6)، مشخص گردید که میزان بیان ژن CRY1 در تیمارهای 2، 4 و 8 ساعت نور آبی، به ترتیب 2/0، 84/0 و 06/2 بوده است. بنابراین با افزایش مدت زمان تیمار نور آبی، میزان بیان این ژن افزایش یافت. در حالی که میزان بیان ژن CRY1 در تیمارهای 2، 4 و 8 ساعت نور قرمز، به ترتیب 15/0، 23/0، 23/0 بوده است (شکل 1، 3). نتایج حاصل با نتایج مربوط به کاهش طول هیپوکوتیل در تیمار 4 و 8 ساعت نور آبی (جدول 2) همخوانی دارد.
برای بررسی ژن HY5 با توجه به (شکل 7 و 8)، پس از رسم Amplification Standard Curveبرای ژن مورد نظر HY5 و B-Actin توسط دستگاهRotor Gene، سپس رسم Standard Curve به طور جداگانه برای ژن اصلی(HY5) و Actin-β به عنوان House keeping gene انجام شد (شکل 9 و10).
CTهای خوانده شده برای تیمارهای مختلف ژن HY5 و Actin-β توسط دستگاه رسم شد (شکل 11 و 12).
شکل 4: الکتروگرام مربوط به بیان ژن کریپتوکروم در دانهرستهای کلزا تحت تیمار نور آبی
به ترتیب از چپ به راست: A: لدر، B: شاهد، C:2ساعت آبی، D:4ساعت آبی، E:8ساعت آبی، F:کنترل منفی، G:کنترل مثبت
شکل 5: الکتروگرام مربوط به بیان ژن کریپتوکروم در دانهرستهای کلزا تحت تیمار نور قرمز
به ترتیب از چپ به راست: A: لدر، B: شاهد، C:2ساعت قرمز، D:4ساعت قرمز،E:8ساعت قرمز،F:کنترل منفی، G:کنترل مثبت
شکل 6: مقایسه میزان بیان ژن کریپتوکروم تحت تیمار نور آبی و قرمز در دانهرستهای کلزا
شکل 7: CT های بدست آمده از منحنی بیان استاندارد (HY5)
شکل 8: CT های بدست آمده از منحنی بیان استاندارد Actin-β
شکل 9: منحنی استاندارد(HY5)
شکل10: منحنی استاندارد Actin-β
شکل 11: منحنی بیان ژن (HY5)
شکل 12: منحنی بیان ژن Actin-β
همچنین (شکل13) نشان میدهد که میزان بیان ژن HY5 در تیمار 2ساعت نور آبی بیشتر از 2ساعت نور قرمز بود. در تیمار 4 ساعت نور آبی و قرمز، تقریباً بیان ژن فوق مشابه و در تیمار 8 ساعت نور قرمز، میزان بیان ژن بیشتری نسبت به تیمار نور آبی، مشاهده گردید. به طور کلی میزان بیان ژن HY5 تحت تیمار نور آبی نسبت به نور قرمز تغییرات کمتری نشان داد.
شکل 13: مقایسه میزان بیان ژن HY5 تحت نور آبی و قرمز در دانهرستهای کلزا
بحث و نتیجهگیری
امروزه هدف از بررسی یک ژن، مشخص کردن تاثیر و عملکرد آن ژن می باشد و ز آن جا که گیاهان، مدلی ساده و مناسب برای بررسی عملکرد ژن خاصی هستند، می توان به کمک آن‌ها بررسیهای عمیق نموی را بهتر دنبال کرد. ژن کریپتوکروم ها نقش ضروری در نمو ایفا میکنند، اما این به این معنا نیست ک طیف عمل مربوطه انحصارا توسط گیرندههای کریپتوکروم اعمال شود، که این مبحث به همپوشانی گیرندههای نوری بر میگردد. در بررسی اثر نور آبی و قرمز بر گیاه کلزا منع از بلند شدن هیپوکوتیل، تحت اثر نور آبی مشاهده شد و این نتیجه، با بررسی بر روی گیاه خیار، مطابقت داشت [4،7].
مهار افزایش طول هیپوکوتیل، در پاسخ به نور، یکی از قابل سنجش ترین فاکتورهای کمّی در روند تکامل است و تا حد زیادی سبب درک بهتر ما از اجزای نظارتی تنظیم کننده در این راستا شده است [5،12، 21،23،36].
مهار افزایش طول محور زیر لپه توسط طول موج نور آبی، نشان دهنده وابستگی پیچیده بین طول موج و میزان کوتاه ماندن هیپوکوتیل را نشان میدهد [9،15،28،37]. البته هنوز نمیتوان چرایی تنوع میزان کمی رشد هیپوکوتیل و اختلاف حساسیت در گونههای مختلف گیاهی، به طیف طول موج آبی، را به راحتی توضیح داد [24] اما میتوان به این نکته اشاره کرد که گیرندههای متعدد، میتوانند طول محور زیر لپه را کنترل کنند، به نحوی که در آرابیدوپسیس فیتوکرومA ، B و گیرنده نور آبی کریپتوکروم به منظور کمک به مهار کردن هیپوکوتیل با هم همکاری میکنند [38]. به نحوی که در آرابیدوپسیس با موتانت فیتوکروم B ،هیپوکوتیل بلند [32 و 34] و با موتانت فیتوکرومA ، هیپوکوتیل بلند [8] و حالت هیپوکوتیل بسیار بلند، در جهش یافته مضاعف مشاهده شده است [31]. البته در گیاه Sinapis alba خلاف این واقعه اتفاق می‌افتد و این گیاه بیشتر به طول موج قرمز و مادون قرمز برای منبع طول هیپوکوتیل وابسته است
[3].
در چند سال اخیر علت کوتاه ماندن هیپوکوتیل را منوط به تغییراتی که نور بر سیستم هورمونی گیاه ایجاد میکند، مرتبط دانستهاند. از آن جا که Brassinostroidها هورمونی است که برای رشد گیاهان ضروری هستند، و در سایر ارگانیسمها شناسایی نشدهاند و این امر باعث میشود این دسته از استروئیدها به فیتوهورمونی منحصر به فرد تبدیل شوند. گونههای آرابیدوپسیس جهش یافته دارای نقص در بیوسنتز هورمون brassinostroide حتی با دریافت نورهای آبی و قرمز توسط گیرندهها، دارای هیپوکوتیل کوتاه هستند. این امر نشان میدهد که brassinostroideها برای بلند شدن هیپوکوتیل لازم و ضروری میباشند.
از دیگر هورمونهای مؤثر، میتوان به اتیلن اشاره کرد که امتداد یافتن هیپوکوتیل جوانههای رشد کرده در تاریکی در گیاه آرابیدوپسیس را افزایش میدهد [25].
البته جیبرلین نیز قادر است طول هیپوکوتیل را کنترل کند به طوری که در خیار و برنج این ارتباط بررسی شده است.تحقیقات اندکی نیز از تاثیر نور آبی بر تغییر سطح و فعالیت جیبرلین گزارش شده است [22]. البته گزارشاتی نیز مبنی بر اثر تغییر سطح فیتوکروم بر میزان جیبرلین،در تنباکو [16] و کلزا [33] وجود دارد (شکل 14)
)