بررسی ارتباط واریانت های ژن UBE2B با تاثیر بر تکامل اسپرم و ناباروری ادیوپاتیک در جمعیتی از مردان شمال ایران

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه ازاد اسلامی واحد تهران شمال

2 کارشناسی ارشد، گروه میکروبیولوژی،دانشکده علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی ،واحد تهران شمال، تهران، ایران.

چکیده

 ناباروری یک مشکل کلینیکی عمده است که حدود 10 تا 15 درصد زوج ها را در سراسر جهان درگیر می کند. 40 تا 50 درصد ناباروری زوجین مربوط به مردان است که می تواند ناشی از برهم کنش بین فاکتورهای ژنتیکی و محیطی باشد. در %58 -37 از موارد ناباروری در مردان هیچ دلیل قابل شناسایی دیده نمی شود. این گروه در جایگاه ناباروری با منشأ ناشناخته قرار می‌گیرند. ژن UBE2B و تغییرات آن به عنوان یکی از این عوامل ژنتیکی ناشناخته محسوب می گردند. هدف این مطالعه بررسی ارتباط پلی مورفیسم های T293G و A20016G از ژن UBE2B با ناباروری در جمعیت مردان شمال ایران بود.
 در این مطالعه نمونه خون 60 مرد بارور و60 مرد نابارور گرفته شد. پس از استخراج DNA از نمونه ها، فراوانی اللی و ژنوتیپی واریانت‌های مذکور به روش PCR-RFLP تعیین گردید.

 نتایج مطالعه ما اختلاف معنی داری در فراورنی آللی بین افراد بیمار و سالم در پلی مورفیسم هایT293G ( P=0.66) و A20016G ( P=0.52 ) از ژن UBE2B نشان نداد.

با توجه به اینکه در فراوانی آلل های مورد مطالعه در گروه بیمار و کنترل تفاوت معنیداری وجود نداشت، به نظر می‌رسد بین این پلی مورفیسم ها و ناباروری ادیوپاتیک مردان شمال ایران ارتباطی وجود نداشته باشد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Study of association between UBE2B variants with susceptibility to Idiopatic infertility in North Iranian male population

نویسندگان [English]

  • elham siasi 1
  • Mohamad sadegh safai 2
1 Islamic Azad University, North Branch Tehran
2 Ms degree of Getetic, Department of Microbiology, Faculty of science, North Tehran Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran.
چکیده [English]

 Infertility is a major clinical problem that involved about 10 to 15 percent of couples worldwide. Male infertility include 40 to 50 percent of all infertility cases and 37-58% of male infertility are unknown, as idiopathic male infertility. This disease is caused by the interaction between genetic and environmental factors. UBE2B gene and its variations is one of the genetic factors in idiopathic male infertility. In this research was studied relation of T293G and A20016G polymorphism in UBE2B genes with the possibility of male infertility in Northern Iranian population.
 For this study, samples from 60 fertile men and 60 infertile men were selected. Then DNA was extracted from samples. Genotype and allele frequencies of the variants were determined by PCR- RFLP.

 Statistical analysis in this study showed no significant association between patient and control groups for T293G (P = 0.66) and A20016G (P = 0.52) SNPs, in UBE2B gene.

The results were indicated that two SNPs was not associated with idiopathic male infertility in Northern Iranian male population.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Idiopathic male infertility
  • polymorphism
  • UBE2B gene
  • PCR-RFLP

اگرچه عّلت دقیق موارد قابل توجهی از ناباروری ناشناخته است، حذفهای کروموزومی، جابجاییها و % از 30 پلیمورفیسمهای تک نوکلئوتیدی در ناباروری [. شناخت و درک اینکه 14 و7 ] مردان دخیل است ناهنجاریها و تنوع های ژنتیکی، مکانیسم اسپرماتوژنز
و لقاح را تحت تأثیر قرار میدهند و شانس غلبه بر ناباروری مردان را افزایش میدهد. از این موارد که از زیر واحدهای یوبی UBE2B ژنتیکی میتوان ژن ) یک Ubiquitin( کوئیتین است را نام برد. یوبیکوئتین کیلودالتن 5/8 پروتئین کوچک، با وزن مولکولی می باشد. از آنجا که این پروتئین در تمام سلول های
UBE2B بررسی ارتباط واریانتهای ژن

با تاثیر بر تکامل اسپرم و ناباروری ادیوپاتیک در جمعیتی از مردان شمال ایران / سیاسی و همکار

22 یوکاریوتی وجود دارد، لذا نام یوبی کوئیتین، برگرفته ( همه جا موجود) بر آن نهاده شده Ubiqitous از است. سکانس آمینواسیدی این پروتئین در موجودات مختلف در طول تکامل ثابت باقی مانده است، که حاکی از نقش مهم این پروتئین در متابولیسم سلولی می باشد. یوبی 70 کوئتین به طور تصادفی در اوائل دهه Gold توسط و70 کشف شد و در اواخر دهه Stain دانشمندان یک سیستم پرتئولیزی غیر 80 اوائل دهه را ATP لیزوزومی وابسته به پروتئین یوبی کوئتین و شناسایی نمودند. اصلی ترین نقش این پروتئین در سلول های یوکاریوتی می باشد. در این سیستم پروتئولیزی یوبی کوئتین طی یک مسیر آنزیمی چند مراحله ایی به پروتئین هدف متصل شده که این امر منجر به شناسایی و تجزیه پروتئین توسط کمپلکس آنزیمی پروتئوزم می شود. به عبارتی این کمپلکس آنزیمی پروتئین هایی را شناسایی و تجزیه می نماید که توسط یوبی کوئتین مدیفای شده باشند. در طول اسپرماتوژنز پروتئین های هسیتون ساختار نوکلئوزومی هسته در نهایت جایگزین پروتامین هسته اسپرمی می شوند. حذف و تجزیه هیستونها بایوبی کوئیتینه .[6 و 4] شدن آنها و دخالت پروتئوزوم همراه است مطالعات نشان داده است که سطح اسپرم های معیوب در حین عبور از مجرای اپی دیدیم یوبی کوئیتینه می گردند، که این امر منجر به شناسایی و فاگوسیته شدن بخشی از اسپرم های معیوب توسط سلول های اپیتـلیال اپی دیدیم می روش 2001 شود. در سال جهت شناسایی Immunoassay Sperm Ubiquitin اسپرم .[17 ] های معیوب در افراد نابارور پیشنهاد شد لازم به ذکر است این روش می تواند در جائی که تست های آنالیز اسپرمی نمی تواند توصیفی در مورد علل ناباروری مردان بدهد بسیار با ارزش باشد.
همچنین در جهت شناسایی صحیح اسپرم های معیوب را بالا می ICSI و IVF درصد موفقیت در برد. نقش سیستم یوبی کوئتین - پروتئوزوم در واکنش آکروزومی Vitteline و نفوذ اسپرم به داخل نیز بررسی Coat شده است. آنتی VC70 Coat ژن سطحی در Vitteline اووسیت طی فرآیندی که جزئیات آن هنوز نامشخص است. یوبی کوئیتینه شده و بدین طریق توسط اکروزومی شناسایی و با تجزیه این S20 پروتئوزوم آنتی Vitteline ژن، نفوذ اسپرم به داخل میسر coat می گردد. لازم به ذکر است که اسپرموزین و اکروزین نیز پروتئین های مهم در عمل نفوذ اسپرم به داخل اووسیت می باشند. مطالعات نشان داده است که میتوکندری پستانداران منحصراً به صورت مادری به ارث می رسد. از آنجا که تخم های لقاح یافته و جنین تکامل یافته تنها دارای میتوکندری مادری هستند به نظر می آید که میتوکندری اسپرم بعد از لقاح از بین می رود. گزارشات بسیاری در مورد نقش یوبی کوئیتین در تجزیه انتخابی میتوکندری اسپرمی بعد از لقاح داده شده است. سیستم پروتئوزوم - یوبی کوئتین در تنظیم روند بلوغ اووسیت نیز نقش دارد. در طول چرخه میوز دو وقفه II میوز تا متافاز I میوتیک از یروفاز میوز می I وجود دارد. اولین وقفه در پروفاز باشد که تا زمان بلوغ ادامه می یابد و با القا های گنادوتردپین ها دوباره سیکل آغاز می میوز مجدداً II گردد و در متافاز سیکل متوقف شده تا مجدداً بعد از لقاح آغاز گردد. یافته ها نشان می دهد در تنظیم این سیکل سیستم یوبی کوئتین - پروتئوزوم، هم از طریق تأثیر در فسفوریلاسیون - دفوسفوریلاسیون و هم تجزیه پروتین های تنظیمی سیکل نقش مهمی بر عهده دارد [. این پروتئین شامل حداقل سه گروه آنزیمی با 3] آنزیم ،E1 نامهای زیر میباشد: آنزیم فعال
فصلنامه
زیست شناسی
تکوینی سال
3 هشتم، شماره
1395 ، تابستان

23
.E3 آنزیم لیگازی ،E2 کونژوگه کننده Ubiquitin ژن – Conjugating Enzyme 2B ) کد کننده یکی از اعضای خانواده آنزیمی UBE2B) از یوبی کوئیتین، با شش اگزون است که در انسان E2 قرار q31.1 , در جایگاه 5 روی بازوی بلند کروموزوم آسیب دیده پس از همانند DNA دارد و برای ترمیم سازی لازم می باشد. این آنزیم طی تکامل یوکاریوتی [. در موش 10] در حد بسیار زیاد حفاظت شده است حذف این ژن با ناباروری به علت ناهنجاریهای .[16] ساختاری اسپرم همراه بوده است ژنوم هر شخص منحصر به فرد میباشد. دادههای نوشته میشود، یک DNA ژنوم که به صورت توالی عامل مهم برای تعیین فنوتیپهای ژنتیکی است. اطلاعات ژنومی اگرچه برای ایجاد فنوتیپ ضروری است، امّا به تنهایی کافی نیست. پیچیدگی بیشتر یک فنوتیپ ناشی از برهمکنشهای پویا و پیچیده بین % از 99/9 ژنوم و فاکتورهای محیطی است. حدود توالی ژنوم در همه انسانها همسان است، اما وجود % تفاوت بیانگر تنوع ژنتیکی است که خطر ابتلای 0/1 افراد به یک بیماری، شدت بیماری و چگونگی پاسخ یک فرد به درمان را تعیین میکند. اشکال مختلف یک ژن که در جایگاه مشخصی از یک کروموزوم قرار گرفتهاند، آلل نامیده میشوند و به وجود آللهای مختلف یک ژن در جمعیت یک گونه که ممکن است باعث ایجاد فنوتیپهای مختلف شوند و فراوانی آنها % اشد، چند شکلی یا 1 در جمعیت بیشتر از پلیمورفیسم اطلاق میگردد. پلی مورفیسمهای ژنتیکی میتوانند در نتیجه فرایندهای تصادفی و یا بر اثر القای عوامل خارجی (ویروسها، پرتو) ایجاد شوند. یکی از انواع پلیمورفیسمها، پلیمورفیسمهای
میباشند که معمول ترین 1)SNP( تک نوکلئوتیدی )%90( منبع تنوع پلیمورفیسمی در ژنوم انسان محسوب میشوند. در حال حاضر مهمترین کاربرد در مطالعات دارویی و بیماریهای وابسته به SNP .[5 و2] پلیمورفیسمهای تک نوکلئوتیدی میباشد روند رو به افزایش ناباروری زوجین و تاثیر عوامل مختلفی که در بروز این عارضه به عنوان یک بیماری، سبب ایجاد مشکلات بسیاری بین زوجها گردیده است، در جوامع امروزی خصوصا در کشور ایران بعنوان یک معزل بهداشتی - عاطفی مطرح است. از موثرترین روشهای بالا بردن آگاهی طبقات اجتماع و کاهش هزینههای درمان را میتوان شناخت عوامل ژنتیکی از جمله جهشها و پلی مورفیسمهای دخیل در ایجاد ناباروری در نظر گرفت. بنابراین شناسایی و تشخیص این فاکتورها می تواند در ارایه راه حل های مناسب جهت درمان این زوجها و کاهش بار اقتصادی و فرهنگی جامعه به خصوص در گروه سنی جوان و کارا کمک موثری باشد. بنابراین این تحقیق برای که UBE2B بررسی حضور واریانتهای جدید در ژن در جمعیت مردان نابارور سایر نقاط جهان مطرح است در جمعیت مردان شمال ایران و ارتباطی که میتواند با ناباروری آنان داشته باشد و به عنوان مارکر ژنتیکی مطرح باشد، پرداخته شده است. تعداد زیادی از تا کنون شناسایی و UBE2B پلیمورفیسمهای ژن [. در 12] ارتباط آنان با ناباروری بررسی شده است 20016 این تحقیق به بررسی دو پلیمورفیسم A>G rs17167484) ) و rs3777373) ) که در 293T>G ناحیه غیر کد کننده این ژن میباشند، پرداخته شده است.


1 SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
UBE2B بررسی ارتباط واریانتهای ژن

با تاثیر بر تکامل اسپرم و ناباروری ادیوپاتیک در جمعیتی از مردان شمال ایران / سیاسی و همکار

24 روش کار - نمونهگیری- در این تحقیق از دو گروه، با اخذ 1 رضایت نامهی کتبی و اطلاعات مربوط به بیمار در قالب پرسشنامه و دادن اطلاعات لازم در مورد پروژه، مرد نابارور 60 نمونه خون گرفته شد. گروه اول شامل مرد سالم و بارور بودند. از افراد 60 و گروه دوم شامل میلی لیتر خون 2 گروه های بیمار و کنترل به مقدار گرفته شد و به منظور جلوگیری از لخته شدن EDTA نمونههای خون درون لولههای آغشته به ذخیره و لولههای حاوی نمونه به یخچال منتقل شدند مورد DNA و در مراحل بعدی جهت استخراج استفاده قرار گرفتند. ژنومی از خون- جهت DNA - استخراج 2 Gpp از خون با DNA استخراج Solution DNA
که محصول شرکت ژن پژوهان است، extraction kit استفاده شد. استخراج شده به کمک DNA - ارزیابی کیفیت 3 DNA ژل آگارز (الکتروفورز افقی)- در این روش % الکتروفورز شد. 0/8 استخراج شده روی ژل آگارز پلیمورفیسمهای PCR - واکنش 4 UBE2B ژن به منظور تکثیر قطعهی PCR واکنش . انجام گرفت 20016A>G و 293T>G حاوی PCR پرایمرها، مواد مورد نیاز و برنامه دستگاه برای آمده است. پس از انجام 4 و3 و2 و1 در جدولهای تحت تاثیر آنزیم محدود PCR واکنش، محصولات کننده قرار گرفتند.

UBE2B پلی مورفیسم های ژن PCR - پرایمرهای مورد استفاده جهت 1 جدول
نام پلی مورفیسم توالی پرایمر طول قطعه تکثیر شده
293T>G
F- 5'-GGATAGTGTTTCTGTTTCGTGGTCT-3' R- 5'-ACTGACAAACAACCCTGCAATGAC-3 240 bp

20016A>G
F- 5'-AGAAAGCTAATACAAAACTATCCTA-3' R- 5'-TGTTAAACGTTGCATAATGAAT-3' 206 bp


ژن PCR - مواد لازم در واکنش 2جدول UBE2B
مواد مصرفی غلظت مقدار 4µl 30 ng الگوDNA 2/5µl 10X بافر 0/75µl 50 mM منیزیم کلراید 0/5µl 10mM (dNTP)دزوکسی نوکلئوتیدتری فسفات 0/3µl 2/5 U پلیمرازTaqآنزیم 100 pmol/ Fپرایمر µ µl 1 100 pmol/ Rپرایمر µ µl 1 14/95µl آب 25µl مجموع


فصلنامه
زیست شناسی
تکوینی سال
3 هشتم، شماره
1395 ، تابستان

25
ژن PCR - چرخه حرارتی 3 جدول UBE2B

293T>Gبرای پلی مورفیسم (°C) مراحل زمان دما واسرشت سازی اولیه واسرشت سازی اتصال آغازگر به رشته الگو بسط پلیمراز بسط نهایی نگهداری دقیقه5 دقیقه1 دقیقه1 دقیقه10 دقیقه5 95 95 5/60 72 72 4

ژن PCR - چرخه حرارتی 4جدول 20016 A>G برای پلی مورفیسم UBE2B (°C) مراحل زمان دما واسرشت سازی اولیه واسرشت سازی اتصال آغازگر به رشته الگو بسط پلیمراز بسط نهایی نگهداری دقیقه5 دقیقه1 دقیقه1 دقیقه10 دقیقه5 95 95 5/57 72 72 4

- الکتروفورز جهت بررسی کیفیت محصول 5 ، نمونهها بر روی PCR - برای بررسی محصول PCR % برده شدند. 2ژل آگارز - کاربرد 6 جهت تشخیص پلیمورفیسم RFLP تک نوکلئوتیدی و 293T>G - جهت 20016A>G 293 تعیین نوع پلیمورفیسم تک نوکلئوتیدی در قطعه PCR که توسط UBE2B جفت بازی از ژن 20016و تحت تیمار با PCRتکثیر شده بود، محصول آنزیمهای محدود کننده مناسب قرار گرفت. آنزیم و T293G برای پلی مور فیسم Taq1محدودکننده A>G20016 برای پلی مور فیسم HpyCH4IIIآنزیم تهیه شده از شرکت فرمنتاز، مورد استفاده قرار گرفت. PCRمواد مورد استفاده جهت هضم آنزیمی محصول برای دو پلیمورفیسم مورد مطالعه به ترتیب در آمده است.6 و 5 جدولهای
پس از اضافه کردن مواد، ویال مورد نظر به آرامی Taq1مخلوط شد و سپس برای عملکرد آنزیم 65 ساعت در انکوباتور با دمای 1 نمونهها به مدت درجه سانتی گراد قرار داده شدند و برای آنزیم ساعت در انکوباتور با دمای 1 به مدت HpyCH4III در جه سانتی 37 گراد قرار داده شدند. در پایان - درجه سانتی 4 محصولات هضم آنزیمی به یخچال گراد منتقل شدند. سپس محصول تیمار با آنزیم بر % برده شدند.3روی ژل آگارز - آنالیز آماری- به منظور تفسیر نتایج به دست 7 آمده از بررسی های آزمایشگاهی، پارامترهای آماری کمی (عددی) مورد نیاز بود. بنابراین با بهره گیری از (Version نرم افزار ، آزمونMed Calc .12.1.4.0) های Chi (χ²)آماری Odd Ratio (OR) - و آزمون Square انجام گرفت و علاوه بر مقادیر ، پارامترهایی ORو χ²
سیکل35

سیکل35
UBE2B بررسی ارتباط واریانتهای ژن

با تاثیر بر تکامل اسپرم و ناباروری ادیوپاتیک در جمعیتی از مردان شمال ایران / سیاسی و همکار

26 P مانند نیز به Interval Confidence (CI) - و value دست آمد.

نتایج - خصوصیات نمونه 1 120 ها- در این تحقیق، نمونه خون مورد بررسی قرار گرفت که از این تعداد نفر نیز 60 نفر مردان مبتلا به ناباروری بودند و 60 مردان باروری بودند که به عنوان گروه کنترل یا سالم در نظر گرفته شدند. آنالیز استاندارد مایع سمن بر
اساس معیارهای سازمان سلامت جهانی در افراد که نتایج اخذ شده از پروندهی ،نابارور انجام شد پزشکی بیماران، طیفی از اختلالات اسپرم را در آنها نشان داده 7 نشان داد. نتایج این بررسی ها در جدول شده است. – استخراج شده DNA - نتایج بررسی کیفیت 2 با الکتروفورز DNA صحت نتایج نمونههای استخراج % و عکس0/8روی ژل آگارز برداری از ژل توسط دستگاه ژل داک تایید شد.

Taq1 برای آنزیم RFLP - مواد مصرفی در واکنش 5جدول موار مور نیاز مقدار 5µl PCRمحصول واکنش بافر R 2µl 1-2µl Taq1آنزیم 12µl آب مقطر استریل 20µl حجم نهایی

HpyCH4III برای آنزیم RFLP - مواد مصرفی در واکنش 6جدول موار مور نیاز مقدار 5µl PCRمحصول واکنش بافر R 2µl 1-2µl HpyCH4IIIآنزیم 12µl آب مقطر استریل 20µl حجم نهایی

- نتایج آنالیز مایع سمن بر اساس پارامتر های اسپرم در مردان نابارور 7جدول متغییرهای مایع سمن تعداد (%)
15 (25%) الیگواسپرمیا
12 (20%) استنواسپرمیا
6 (10%) ترتواسپرمیا
12 (20%) الیگواستنواپرمیا
15 (25%) نرمواسپرمیا


فصلنامه
زیست شناسی
تکوینی سال
3 هشتم، شماره
1395 ، تابستان

27
- نتایج حاصل از واکنش زنجیرهای پلیمراز 3 ) در مورد PCR )- واکنش زنجیرهای پلیمراز ( PCR( نمونه ها انجام گرفت و نتایج تکثیر دو پلی مورفیسم آورده شده است.2 و 1مورد نظر در شکل

- نتایج حاصل از ژنوتایپینگ پلیمورفیسمهای 4 - در این تحقیق پلیمورفیسم تک UBE2B در ژن 20016 و 293نوکلئوتیدی موقعیت UBE2B مورد بررسی قرار گرفت. - نتایج حاصل از ژنوتایپینگ پلیمورفیسم 1-4 T293G - نتایج هضم آنزیمی پلیمورفیسم 293T>G 240 bp باند A آورده شده است. در ستون 3در شکل TTنشانگر ژنوتیپ از نوع هموزیگوت وحشی B میباشد و برش آنزیمی ایجاد نشده است. در ستون وجود باندهای bp 2 دلیل بر هضم 70 و 170 ،40 میباشد. در ستون TGآنزیمی و وجود هتروزیگوت 70 و 170 bp برش آنزیمی ایجاد شده و دو باند C
بیانگر هموزیگوت موتانت ،D میباشد. ستون GG را نشان میدهد. 100 bpمارکر مولکولی - نتایج حاصل از ژنوتایپینگ پلی مورفیسم 2-4 20016A>G در A20016G نتایج هضم آنزیمی پلیمورفیسم نشانگر 260 bp باند A آمده است. در ستون 4شکل بود که برش AAژنوتیپ از نوع هموزیگوت وحشی وجود Bآنزیمی ایجاد نشده است. در ستون دلیل بر وجود هضم 45و 161 ،206 bp باندهای C بود. در ستو ن AGآنزیمی و وجود هتروزیگوت بیانگر 45و161 bp برش آنزیمی ایجاد شده و دو باند دارای مارکر D بود. ستون GGهموزیگوت موتانت بود.100 bpمولکولی

- نتایج آنالیزهای آماری پلیمورفیسمهای 5 UBE2B UBE2B - بررسی فراوانی آللی 1-5 293T>G - نتایج فراوانی اللی در افراد بیمار و سالم به ترتیب در آمده است.9 و 8 جدول



293T>G برای پلی مورفیسم PCR - باند حاصل از محصول 1شکل

ژن

UBE2B

است).240 bp(دارای طول



bp 293T>G 240bp
UBE2B بررسی ارتباط واریانتهای ژن

با تاثیر بر تکامل اسپرم و ناباروری ادیوپاتیک در جمعیتی از مردان شمال ایران / سیاسی و همکار

28


20016A>G برای پلی مورفیسم PCR - باند حاصل از محصول 2شکل

ژن UBE2B

است).206 bp(دارای طول

- نتایج هضم آنزیمی پلی مورفیسم 3شکل
: نمونه C - خانه 100 bp: مارکر مولکولی D - از راست به چپ - خانه UBE2B از ژن T293G : نمونه هتروزیگوت B )- خانه 170bp ,70bp( GGهموزیگوت موتانت : نمونه هموزیگوت وحشیA )- خانه 240bp , 170bp ,70bp(TG TT (240bp).



: نمونه C - خانه 100 bp: مارکر مولکولی D - از راست به چپ - خانه UBE2B از ژن A20016G - نتایج هضم آنزیمی پلیمورفیسم 4شکل : نمونه هتروزیگوت B )- خانه 161 bp ,45bp( GGهموزیگوت موتانت : نمونه هموزیگوت وحشی A )- خانه 206 bp , 161 bp , 45 bp(AG AA (206 bp.)
A

B

C

D

240 bp
70bp
170bp bp
100 bp
bp
20016A>G 206 bp


100 bp
bp
A

B

C D

D
206 bp 161 bp
45 bp
100 bp
bp
فصلنامه
زیست شناسی
تکوینی سال
3 هشتم، شماره
1395 ، تابستان

29
- نتایج مربوط به فراوانی آللی افراد بیمار 8جدول پلی مرفیسم میزان فراوانی در صد فراوانی TT 50 3/83 GG 2 3/3 GT 8 4/13

- نتایج مربوط به فراوانی آللی افراد سالم 9جدول پلیمرفیسم میزان فراوانی در صد فراوانی TT 48 80 GG 1 7/1 GT 11 3/18

UBE2B - بررسی فراوانی آللی 2-5 20016A>G نتایج فراوانی اللی در افراد بیمار و سالم به ترتیب – . آمده است11 و 10در جدول

- نتایج مربوط به فراوانی آللی افراد بیمار 10جدول پلی مرفیسم میزان فراوانی در صد فراوانی AA 42 70 GG 4 6/6 GA 14 4/23

- نتایج مربوط به فراوانی آللی افراد سالم 11جدول پلیمرفیسم میزان فراوانی در صد فراوانی AA 47 3/78 GG 2 3/3 GA 11 4/18

- آنالیزهای نرمافزاری جهت بررسی 3-5 معنیدار بودن ارتباط پلی مورفیسم با بیماری - ارتباط 293T>G - پلیمورفیسم 1-3-5 در بیماران با افراد UBE2B ژن T293G پلیمورفیسم سالم مورد بررسی قرار گرفت. برابر با P. Value Contingency ضریب هم بستگی ( t و 0/667
که نشان داد این ، بود 0/081) برابر coefficient پلیمورفیسم با بروز بیماری در ارتباط نمی باشد. نتایج نشان داده شده است.12در جدول

- نتایج مربوط به فراوانی آللی پلیمورفیسم 12جدول 293T>G Chi square 1.308 DF 2 Significance level P:0.667 Contingency coefficient 0.081
- جهت 20016A>G - پلی مورفیسم 2-3-5 Chi بررسی معنیدار بودن نتایج از آزمون -Square استفاده شد .طی آنالیز آماری مربوط به فراوانی آللی ، با توجه به UBE2B ژن 20016A>G پلی مورفیسم تفاوت معنیداری در فراوانی آللی بین دو Pمقدار ،ORگروه بیمار و کنترل مشاهده نشد. به منظور تعیین Odds از آزمون P Value و CI - با کمک برنامه Ratio استفاده گردید. Med Calc )v.12.1.4.0 نرمافزاری ( نشان داده شده است.13نتایج در جدول
20016A>G - نتایج مربوط به فراوانی آللی پلیمورفیسم 13جدول Chi square 1.308 DF 2 Significance level P:0.5201 Contingency coefficient 0.104
بحث اسپرماتوژنز فرایندی پیچیده است که از لحاظ آناتومی در بیضه ها و درون لولههای اسپرم ساز اتّفاق میافتد. واضح است که در چنین مجموعه فرایندهای بسیاری از عوامل ژنتیکی و غیرژنتیکی ،پیچیده [. از 14 و 1] میتوانند تولید اسپرم را مختل کنند آنجایی که این شکل از تقسیم منحصر به گامتوژنز است، میتوان انتظار داشت که جمعیتی از پروتئینها و بنابراین ژنهای کد کنندهی آنها، مخصوصاً آن جنبههایی که متمایز از میتوز هستند، منحصراً مربوط
UBE2B بررسی ارتباط واریانتهای ژن

با تاثیر بر تکامل اسپرم و ناباروری ادیوپاتیک در جمعیتی از مردان شمال ایران / سیاسی و همکار

30 [. با وجود این که تعدادی از 6]به گامتوژنز هستند ژنهای دخیل در اسپرماتوژنز شناسایی شده اند اما هنوز عملکرد دقیقشان نامشخص است و میتوانند در [. اختلال در 15]باروری مردان نقش موثر داشته باشند پتانسیل باروری مردان میتواند به دلایل مختلف مادرزادی و اکتسابی باشد، مانند کریپتوکیدیسم، سندروم کلاین فلتر، اختلالات انسدادی، واریکوسل، .[8] عفونت دستگاه تناسلی، اختلالات غدد درونریز از موارد ناباروری در مردان هیچ دلیل 37- 58در % قابل شناسایی دیده نمیشود. این گروه در جایگاه ناباروری با منشأ ناشناخته قرار میگیرند. ناباروری با منشأ ناشناخته، حالتی است که نقص در باروری به صورت خودبهخودی یا بر اثر دلایل ناشناخته و مبهم بروز میکند که به دو گروه ناباروری غیر قابل توصیف [. از این 8] و ناباروری ایدیوپاتیک تقسیم میشود موارد ژنتیکی که در ایجاد ناباروری ادیوپاتیک نقش که از زیر واحدهای یوبی کوئیتین UBE2Bدارند ژن است، میباشد. یکی از مسیرهای تجزیه پروتئین در ATP یوکاریوتها یوبی کوئیتین است که وابسته به میباشد. این مسیر دارای یک نقش کلیدی در تجزیه پروتئینها است به وی



زه مربوط به تخریب پروتئینهایی که به صورت اشتباه چین خورده و آنزیمهای تنظیمی با نیمهعمر کوتاهی هستند، میباشند. تحقیقات زیادی بر روی یوبی کوئیتین انجام گرفته است و نقش اثبات DNA آن در تنظیم چرخهی سلولی و ترمیم شده است. در طول اسپرماتوژنز پروتئین های هسیتون ساختار نوکلئوزومی هسته، جایگزین پروتامین هسته اسپرمی می شوند. حذف و تجزیه هیستونها بایوبی کوئیتینه شدن آنها و دخالت پروتئوزوم همراه است [. هنگامی که یک مولکول یوبی کوئیتین به پروتئین 4] متصل میشود تعداد دیگری هم متصل میشوند که
سبب پلی یوبی کوئیتینه شدن پروتئین هدف میگردد. تخمین زده شده است که حداقل باید چهار مولکول یوبی کوئیتین به مولکول هدف متصل شود تا متحمل تجزیه در پروتئوزوم گردد. یوبی کوئیتین میتواند از پوتئین هدف ، توسط آنزیمهای دیوبی کویتینه کننده جداشود و یوبی کوئیتین آزاد میتواند مجددا مورد [. به دلیل اهمیت ناباروری 13]استفاده قرار گیرد مردان و نقش یوبی کوئیتین در آن و با در نظر گرفتن با UBE2Bنقش احتمالی پلی مورفیسم عملکردی ژن ناباروری مردان، تحقیق حاضر با هدف بررسی پلیمورفیسمهای 293T>G و از ژن 20016A>G با ناباروری ایدیوپاتیک در جمعیتی از مردان UBE2B استان گیلان انجام شد. در این تحقیق به منظور بررسی UBE2B ) در ژنوتیپهای G و Tفراوانی آللی (
در (A,G) ) و فراوانی آللی GG و GT ،TT( 293T>G , ،AA( UBE2B 20016A>G ژنوتیپهای AG GG ) فرد 60 فرد بیمار و 60در جمعیت مورد مطالعه ( PCR کنترل) از روش - استفاده گردید. نتایج RFLP حاصل پس از نمایش روی ژل آگارز با نرمافزار مورد بررسی قرار گرفت و نشان داد که Med Clac اختلاف مشاهده شده بین افراد بیمار و سالم با توجه Chi به نتیجه آزمون - از لحاظ آماری معنیدار Square نبود. بنابراین توزیع نوع آلل مربوطه در بین افراد سالم و بیمار متفاوت نیست و حضور آلل با توجه به G نتایج یک فاکتور خطر محسوب نمیشود. نتایج پیشنهاد می کند که احتمالاً این ژنوتیپها نمی تواند خطر ابتلا به ناباروری را در مردان افزایشدهد و فاکتور مرتبط با ناباروری محسوب نمی شود . توسط آقای 2012در این زمینه تحقیقاتی در سال فرد 388 فرد سالم و 312هو و همکاران بر روی نابارور صورت پذیرفت. در این تحقیقات فراوانی دو
فصلنامه
زیست شناسی
تکوینی سال
3 هشتم، شماره
1395 ، تابستان

31
UBE2B از ژن A20016G و T293G پلیمورفیسم مورد بررسی قرار گرفت و نشان داد که ارتباط معنا داری در فراوانی آللی بین دو پلی مور فیسم بین گروه کنترل و بیمار وجود ندارد و همچنین تفاوت معناداری در فراوانی ژنوتیپی این دو پلیمورفیسم نیز در دو گروه مشاهده نشد. آنالیز هاپلوتایپ روی این دو TA, TG, هاپوتایپ 4 پلیمورفیسم صورت گرفت و مشخص گردید و روشن شد توزیع GA, GG TA, TG, هاپلوتایپ بین گروه کنترل و بیمار GG در GAتفاوت معنا داری ندارد. اما فراوانی هاپلوتایپ گروه بیمار به طور مشخصی پایین تر از گروه کنترل بود. هاپلوتیپ یک مجموعه از چند شکلی های تک نوکلئوتیدی (اسنیپ ها) روی یک کروموزوم از جفت کروموزومی است که به صورت آماری هم بسته هستند. به نظر می رسد با استفاده از این هم بستگی ها و شناسایی تعداد کمی از الل های یک بلوک هاپلوتیپی، می توان به صورت بدون ابهام همه مکان های چند شکلی را در آن ناحیه خاص تشخیص داد. چنین اطلاعاتی در تحقیق برای عوامل ژنتیکی بیماری های شایع بسیار ارزشمند هستند، و در پروژه بینالمللی برای انسان HapMap ها مورد تحقیق قرار گرفته اند [. در تحقیق حاضر که در شمال ایران انجام شد نیز 9] مانند تحقیق آقای هو که در شمال چین انجام گرفت، ارتباط معنا داری بین فراوانی این پلیمورفیسمها و ناباروری مشاهده نشد. البته تعداد افراد مورد مطالعه در تحقیقی که در ایران صورت گرفت بسیار کمتر از تحقیق انجام شده در چین بود که این امر میتواند در نتیجه نهایی تاثیر گذار باشد. آقای لیشا و همکاران, تحقیقاتی 2015در سال UBE2B از ژن 133706925 A>G روی پلیمورفیسم
و ارتباط آن با ناباروری ادیوپاتیک آزواسپرمیا انجام
دادند. این پلی مورفیسم در ناحیه پرموتر واقع شده و به عنوان یک فاکتور خطر بالا برای ناباروری محسوب UBE2B می شود. این یافتهها تائیدی بر نقش
در
.[12] پاتوژنز آزواسپرمی ادیوپاتیک داشت در آقای سوریاواتی و همکارانش به 2008 سال UBE2Bمنظور بررسی نقش
در ناباروری
دو پلیمورفیسم
5197 T>G
و
در 9157 A>G
530
فرد
نابارور
فرد سالم را مورد آزمایش قرار دادند. 300و نتایج حاصل نشان داد که این دو جهش فقط در افراد نابارور مشاهده میشوند. سه پلیمورفیسم دیگر نیز در (293 T>G این طرح بررسی گردید شامل - و rs17167484) (19765 T>G- rs11538104) که از این میان (20016 A>G- rs3777373) تنها در افراد آزواسپرمیا و 19765 T>G پلیمورفیسم در هر دو گروه سالم و 20016 A>G و 293 T>G بیمار مشاهده شد و از این جهت مشابه نتایج بدست امده از تحقیقات انجام شده در شمال ایران است. 9157 A>G و 5197 T>G هاپلوتایپ برای 4تعداد مشاهده شد. توزیع این هاپلوتایپها بین دو گروه TAیکنواخت نبود. فرکانس بالای هاپلوتایپ
در افراد سالم نسبت به افراد بیمار حاکی از این است که این هاپلوتایپ می تواند یک مزیت و فاکتور مطلوب برای TG باروری باشد. این در حالی است که که هاپلوتیپ یک عامل مستعد کننده برای نقص در اسپرماتوژنز در هر دو گروه در یک GG و GA .شناخته شد فرکانس پایین مشاهده شدند ] 16 [ . توسط یاتسنکو و 2013در تحقیقاتی که در سال از mRNAهمکاران صورت گرفت ارتباط تعییرات در با ناباروری بررسی گردید. این تحقیقات UBE2Bژن فرد 421 فرد بیمار الیگواسپرماتیک و 326بر روی RT سالم و با تکنیک - صورت گرفت که PCR
UBE2B بررسی ارتباط واریانتهای ژن

با تاثیر بر تکامل اسپرم و ناباروری ادیوپاتیک در جمعیتی از مردان شمال ایران / سیاسی و همکار

32 cDNAرویکرد آن ساخت

RNAاز کل محتوای
اسپرم و بررسی آن بین گروه سالم و بیمار بود. نتیجه mRNAحاصل این بود که نرخ تشخیصی
بین دو گروه کنترل و بیماران الیگواسپرماتیک تفاوت [18] معناداری نداشت .
در تحقیق آقای ایوان هونگ در آمریکا که بر روی UBE2B مرد نابارور صورت گرفت به بررسی ژن 96 پرداخته شد. در این تحقیق پس از تکثیر بخش اگزون، ABI 3700 Capillary sequencer قطعات با دستگاه ،1تعیین توالی شدند. این تعیین توالی بر روی اگزون 5' و 6 ،5 ،4 ،3 ،2 - صورت گرفت. در این UTR در T293G پژوهش مشخص شده بود که پلیمورفیسم مردان نابارور اروپایی تبار شمال آمریکا دارای فراوانی درصد بوده و که از لحاظ آماری تفاوتی با میزان 5,2 Hap Ma فراوانی که در [10] ارائه شده بود نداشت p .
T293G در تحقیق حاضر فراوانی پلیمورفیسم -RFLPباتکنیک مورد بررسی قرار گرفت و PCR مانند تحقیق فوق ارتباط معناداری بین نا باروری و پلیمورفیسم فوق به دست نیامد، البته در تحقیق فوق به علت این که پلیمورفیسمهای بیشتری از ژن مورد بررسی قرار گرفته است از تکنیک UBE2B توالی سنجی استفاده شده ولی در تحقیقی که در ایران T293Gانجام گرفت به علت بررسی دو پلی مورفیسم استفاده گردید. PCR-RFLP از تکنیک A20016Gو PCR-RFLPاز لحاظ تکنیک به کار رفته تکنیک برای بررسی دو پلیمورفیسم مناسب بوده و در بیشتر ها کارایی موثری SNPموارد مطالعه در خصوص دارد. در این روش نمونه ای تکثیر شده را با DNA از یک نوع آنزیم برشی، هضم می کنند که در نتیجه تعداد زیادی قطعه با طول متفاوت بدست می آید، سپس این قطعات با استفاده از ژل آگارز از هم دیگر جدا
می شوند و جهشهائی از نوع نقطه ای و حذف و اضافه که باعث تغییر درسطح قطعه آنزیمی می گردند قابل تشخیص است . با توجه به آزمایشات صورت گرفته و همچنین آنالیز آماری میتوان این چنین گزارش کرد که فراوانی UBE2B ژن A20016G و T293Gدو پلی مورفیسم احتمالا با بروز خطر ابتلاء به ناباروری در جمعیت شمال ایران دارای ارتباط معناداری نمیباشد. به و 293عبارت دیگر حضور گوانین در موقعیت از این ژن یک فاکتور خطر در 20016همچنین جمعیت مورد مطالعه محسوب نمیشود. البته این نتیجه گیری فقط یک احتمال را نشان داده است، چرا که ممکن است با افزایش تعداد نمونههای مورد مطالعه خصوصا در جمعیتها و سایر قومیتها نتایج متفاوتی مشاهده شود و ممکن است بررسیهای هاپلوتایپی در این زمینه معنی دار باشد و نیازمند تحقیقات بعدی در این خصوص می باشد.

[1] Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K.,Walter P. 2002. Molecular Biology of the Cell. Annals of Botany, 91(3): 401.

[2] Aston K.I., Krausz C., Laface I, Castané E.R., Carrell D.T. 2010. Evaluation of 172 Candidate Polymorphisms for Association With Oligozoospermia or Azoospermia in a Large Cohort of Men of European Descent. Hum Reprod, 25 (6): 1383-1397.

[3] Baarends W. M., Wassenaar E., Hoogerbrugge J.W., van Cappellen G., Roest H.P., Vreeburg J., Ooms M., Hoeijmakers J.H., Grootegoed J.A. 2003. Loss of HR6B ubiquitin-conjugating activity results in damaged synaptonemal complex structure and increased crossing-over frequency during the male meiotic prophase. Mol Cell Biol, 23(4): 1151-1162.

[4] Ciechanover A. 1996. Ubiquitin-mediated proteolysis and male sterility. Nat Med, 2(11): 1188-1190.

[5] Collins F.S., Brooks L.D., Chakravarti A. 1998. A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation. Genome Res, 8(12): 1229-1231.

[6] Eliasson R. 2010. Semen analysis with regard to sperm number, sperm morphology and functional aspects. Asian J Androl, 12: 26-32.

[7] Ferlin A., Raicu F., Gatta V., Zuccarello D., Palka G., Foresta C. 2007. Male infertility: role of genetic background. Reprod Biomed Online, 14(6): 734-745.

[8] Hamadaa A., Esteves S.C., Agarwal A. 2011. The role of contemporary andrology in unraveling the mystery of unexplained male infertility. The Open Reproductive Science Journal, 4: 27-41.

[9] Hu Y., Wen W., Yu J.G., Qu S.Q., Wang S.S., Liu J., Li B.S., Luo Y. 2012. Genetic association of UBE2B variants with susceptibility to male infertility in a Northeast Chinese population. Genet Mol Res, 11(4): 4226-4234.

[10] HuangI., EmeryB.R., Christensen G.L., GriffinJ., Peterson C.M., Carrell D.T. 2008. Novel UBE2B-associated polymorphisms in an azoospermic oligozoospermic population. Asian J Androl, 10(3): 461–466.

[11] Krausz C. 2011. Male infertility: pathogenesis and clinical diagnosis. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab, 25: 271-285.
[12] Mou L., Zhang Q., Diao R., Cai Z., Gu Y. 2015. A functional variant in the UBE2B gene promoter is associated with idiopathic azoospermia. Reprod Biol Endocrinol, 13 : 79.

[13] Olayemi FO. 2010. A review on some causes of male infertility. African Journal of Biotechnology, 9: 2834-2842.

[14] Pasqualotto F.F., Agarwal A. 2009. Varicocele and male infertility: an evidence based review. Arch Med Sci, 5: S20–S27.

[15] Seshagiri P.B. 2001. Molecular insights into the causes of male infertility. J Biosci, 26(4): 429435.

[16] Suryavathi V.N.,Khattri A., Gopal K., SelviRani D., Panneerdoss S., Gupta N., Chakravarty B., Deenadayal M., SINGH L., Thangaraj K. 2008. Novel Variants in UBE2B Gene and Idiopathic Male Infertility. Journal of Andrology, 29(5): 564-571.

[17] Sutovsky P., Terada Y., Schatten G. 2001. Ubiquitin-based sperm assay for the diagnosis of male factor infertility. Hum Reprod, 16(2): 250-258.

[18] Yatsenko A.N., Georgiadis A.P., Murthy L.J., Lamb D.J., Matzuk M.M. 2013. UBE2B mRNA alterations are associated with severe oligozoospermia in infertile men. Molecular Human Reproduction, 19(6): 388–394.