نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 استادیارگروه زیست شناسی، واحد رودهن ، دانشگاه آزاد اسلامی ، رودهن ، ایران
2 گروه زیستشناسی، واحد تهران شمال، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
چکیده
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic condition of the intestine with unknown etiology involving multiple immune, genetic and environmental factors. We were interested to examine the effect of extract from Lippia citrodoria, a medicine plant in prevention and control of experimental mouse IBD. L.citrodoria was administered (50, 150.200 mg/kg) through drinking water to IBD mice (induced by intrarectal administration of acid-induced). Prednisolone was used as the standard drug for comparison. Biochemical, macroscopic and microscopic examination of colon were performed. Biochemical evaluation of inflamed colon was done using assay of myeloperoxidase (MPO) activity and thiobarbituric acid reaction substances(TBARS) concentration as indicators of free radical activity and cells lipid peroxidation. Results indicated that the activity of MPO and lipid peroxidation products (TBARS) increased in acetic acid-treated group while recovered by pretreatment of animals with L.citrodoria (50,150,200 mg/kg) and prednisolone. L.citrodoria (50-100mg/kg) and prednisolone. L.citrodoria (50-200 mg/kg) and prednisolone-treated groups showed significantly lower score values of macroscopic and microscopic characters when compared to the acetic acid – treated group. The benefical effect of L.citrodoria ( 200mg/kg) was comparable to that of prednisolone.It is concludes that the antioxidant, antimicrobial, and anti-inflammatory potentials of L.citrodoria might be the mechanisms by which this extract protects animals against experimentally induced IBD. Proper clinical investigation should be carried out to confirm the activity in human
کلیدواژهها [English]
بیماریهای التهابی روده باعث فعال شدن مزمن و التهاب دستگاه گوارش میشود. از لحاظ بافتشناسی، التهاب رودهای با تراوش لوکوسیتهای پلیمورفونوکلئر، مونوسیتها و ماکروفاژها مشخص میشود [3،4]. دو بیماری کرون و کولیت اولسرایتو دو شکل اصلی هستند، فاکتورهای ژنتیکی، عوامل عفونی و ایمونولوژیک، دخانیات، داروها و نیز برخی از فاکتورهای پاتولوژیک در پاتوفیزیولوژی نقش دارند [8، 6]. همچنین تنش اکسیداتیو نقش اساسی در پاتوژنز آسیب رودهای در ارتباط با دارد [7]. عدم موازنه قابل توجه در فعالیت آنتیاکسیدانی تام بهطوریکه تنش اکسیداتیو افزایش یافته و محافظت آنتیاکسیدانی کاهش یابد، در نمونهبرداریهای مخاط کولونی مشخص شدهاند [1،2،4]. اگر میزان رادیکالهای آزاد زیاد و یا محافظت آنتیاکسیدانی کم باشد حالتی از تنش اکسیداتیو پیش میآید که ممکن است باعث آسیب مزمن یا پایدار به سلولها شود. یکی از مارکرهای استراس اکسیداتیو، افزایش پراکسیداسیون لیپیدی در سلولهاست که از طریق اندازهگیری میزان مواد واکنش دهنده با تیوباربیتوریک اسید مشخص میشود [5،9]. مطالعات پیشین وجود تنش اکسیداتیو را در مایعات بیولوژیک مانند بزاق و پلاسما در بیماران مبتلا به نشان دادهاند [1،7]. اثر بخشی روشهای درمانی گوناگون در درمان را ممکن است بتوان به عملکرد آنتیاکسیدانی آنها نسبت داد [9-13]. ترکیباتی نظیر سولفاسالازین و متابولیتهایش، 5- آمینوسالیسیلیک اسید که در درمان استفاده میشوند به عنوان حذفکنندگان بسیار مؤثر ترکیبات فعال اکسیژن میباشند [14،11]. نوتروفیلها نقش عمدهای در واکنشهای التهابی و ایمنی در ایفا میکنند [14]. آنزیم میلوپراکسیداز قادر به تشکیل تعداد زیادی مواد اکسیدان بوده بهطوریکه اکسیداسیون ترکیبات دهندۀ الکترون (مثل هالیدها) را توسط پراکسید هیدروژن کاتالیز میکند. همچنین مشخص شده که میزان فعالیت که بیشتر در گرانولهای نوتروفیلی یافت شده و مشخص کنندۀ تعداد نوتروفیلهاست در مدل تجربی القاء شده با استیکاسید افزایش مییابد [14]. کولیت القاء شده با استیکاسید یک مدل آسان ایجاد ست و شباهت پروفایل مدیاتورهای التهابی در این مدل یا در انسان نشان میدهد که فاز التهابی، شباهتهایی با التهاب رودهای در انسان دارد [15]. مشخص شده که تعداد زیادی از عصارههای گیاهی در وضعیتهای مزمن التهابی مؤثر هستند. گیاه به لیمو با نام علمیLippia citrodoria، یکی از گیاهان دارویی متعلق به تیره شاه پسند است که بومی آمریکای جنوبی، شیلی و پرو میباشد [15]. در حال حاضر درختچه این گیاه به دلیل اهمیت اقتصادی و دارویی در نواحی شمال ایران به ویژه در استان گلستان کشت داده میشود [16،18]. در طب سنتی از این گیاه در درمان سردرد، سرگیجه، دل پیچه، دل درد و سوء هاضمه، بهبود علائم سرماخوردگی، بهبود تپش قلب، کنترل اسهال، مهار رشد اشریشیاکلی و میکروباکتریوم توبرکلوزیس و استافیلوکوکوس اورئوس در مطالعات درون شیشه، استفاده شده است [17،19]. با توجه به فعالیتهای گزارش شده برای این گیاه و نیز مطالب گفته شده در مورد IBD، برای اولین بار اثرات عصاره هیدروالکلی این گیاه در درمان بیماری IBD در موش بررسی همچنین وضعیت تنش اکسیداتیو را از طریق
اندازهگیری میزانTBARS و آنزیم میلوپراکسیداز و بررسیهای میکرو و ماکروسکوپیک در روده در مدل کولیت القاء شده با استیک اسید انجام شد.
مواد و روشها:
جمعآوری گیاه وعصارهگیری
بهلیمو از استان گلستان جمعآوری و توسط بخش هر باریوم دانشکده داروسازی، دانشگاه تهران تایید شد (کد شماره 1524-Aups). قسمتهای هوایی گیاه L.citrodoia پس از خشک کردن در سایه با آسیاب پودر، سپس 40 گرم از پودر حاصل با متانول به روش پرکولاسیون عصاره گیری شد. عصاره متانولی بعد از صاف شدن، در شرایط خلأ و حرارت پایین تقطیر شد. عصاره غلیظ بدست آمده با کلروفرم واترپترول شستشو داده شد. محلولهای کلروفرمی را روی هم ریخته و جداگانه شدند و باقیمانده عصاره متانولی بدست آمده در آب حل شد. سپس غلظتهای 00mg/kg، 100 و 50 به موشها از راه دهان داده شد.
حیوانات آزمایشگاهی و بررسیهای هیستولوؤیک
در این تحقیق از24 عدد موش نر نژاد Balb/c در محدوده وزنی (28 گرم) در هر گروه استفاده شد. که در 4 گروه شش تایی برای انجام این پژوهش قرار داده شدند: گروه اول: گروه نرمال که درمان دارویی و اسید استیک دریافت نمیکنند. گروه دوم: گروه کنترل که 0.1 سی سی محلول استیک اسید 6 درصد بصورت داخل مقعدی دریافت میکنند. گروه سوم : عصاره گیاهی بصورت دهانی و 0.1 سی سی استیک اسید 6 درصد دریافت میکنند، گروه چهارم: تجویز خوراکی سوسپانسیون حاوی 0.5% پردنیزولون با دوز mg/kg
1.14 به مدت 3 روز و اسید استیک داشتند. تجویز پردنیزولون از زمان تجویز استیک اسید شروع و به مدت 3 روز ادامه داشت. حیوانات با پنتوباربیتال (40mg/kg , i.p.) بیهوش و استیک اسید از طریق مقعد وارد روده شد. 48 ساعت پس از تجویز استیک اسید حیوان کشته شد و پس از درآوردن کولون و شستشو با نرمال سالین، به منظور ارزیابی هیستوپاتولوژیک، کولون در فرمالین سالین 10 درصد، ثابت و پس از تهیه قطعات 5 میکرومتری از بافت روده بزرگ، برشها در هماتوکسیلین وائوزین
رنگآمیزی شدند.، قطعات رنگ آمیزی شده از لحاظ ارتشاحات سلولی، آسیب ساختارهای سلولی (infiltration)، آسیبهای سلولی مانند پلاکهای
پییر، آسیب به هسته و غیره توسط میکروسکوپ نوری بررسی شدند. جهت فیکس کردن بافت ها از فرمالدئید 10 درصد استفاده شد سپس فرمالین اضافی با آب شسته شده و در الکل 70 درصد فیکس کردن ادامه یافت [13]. سپس بافت در پارافین قرار داده شد، اززایلین به عنوان ماده شفاف ساز استفاده شد. بعد از عمل شفافسازی، زایلین به راحتی در حمام پارافین تبخیر و نمونهها به یک حمام پارافین مذاب در یک دوره قالب گیری برای نفوذ و آغشتگی منتقل و بافت نفوذ یافته آغشته به پارافین داخل پارافین مذاب قرار داده شد سپس برش های نازک بافتی توسط میکروتوم تهیه و برشها روی لام چسبانده و رنگ آمیزی شدند.
بررسی آنزیمی و استرس اکسیداتیو
جهت بررسی فعالیت آنزیم میلوپراکسیداز (MPO)، کولون خارج شده از حیوان با نرمال سالین شستشوو توسط کاغذ صافی خشک، توزین و تکه تکه
شد. هموژنیزاسیون بافت تکه تکه شده در 10 حجم با فر فسفات (PH=7.4) و سانتریفیوژ در دور g 3500 به مدت 30 دقیقه و دمای 4 درجه سانتی گراد انجام شد. محلول فوقانی برای تست TBA با افزودن 10 میلی لیتر با فرفسفات 50 میلی مولار (PH=6) حاوی هگزا دسیل تری متیل آمونیوم بروماید (HETAB) 0.5 درصد و EDTA 10 میلیمولار، سونیکه و سپس سانتریفیوژ در دور g 12000 بمدت 20 دقیقه انجام شد در نهایت فعالیت آنزیم MPO توسط اسپکتوفوتومتر به صورت زیر اندازهگیری گردید: افزودن 0.1 میلیلیتر از محلول فوقانی به 2.9 میلیلیتر با فرفسفات 50 میلیمولار (PH=6) حاوی O-dianisidine هیدروکلراید 0.167 mg/ml و0.0005 H2O2 درصد؛ سپس جذب محلول در طول موج 460 نانومتر خوانده شد. جهت بررسی استرس اکسیدایتو، از روش تیوباربیتوریک اسید (TBA) استفاده شد بطوریکه که محلول فوقانی حاصل از هموژنیزاسیون و سانتریفیوژ به TBA اضافه و جذب در طول موج 530 نانومتر خوانده شد.
آنالیز آماری
از نرم افزار آماری SPSS و آنالیز واریانس Anova و نیز تست Post Hoc جهت مقایسههای چندگانه استفاده شد. نتایج به صورت MeanSEM نشان داده و در مورد هرمقایسه آماری 0.05P< معنیدار در نظر گرفته شد.
نتایج
تجویز داخل مقعدی استیک اسید باعث تغییرات التهابی در کولون گردید. در مقایسه با گروه کنترل، میزان خراشیدگی کولون برای ویژگیهای ماکروسکوپی و میکروسکوپی در گروههای تحت درمان با گیاه Lippa citrodoria با غلظت (200 -50 mg/kg) و پردنیزولون (1.14 mg/kg) بسیار کمتر بود، بطوریکه اثرات مثبت عصاره به لیمو به ویژه غلظت (200mg/kg) روی تغییرات ماکروسکوپی و میکروسکوپی القا شده با استیک اسید در کولون مشابه اثرات پردنیزولون بود. میزان فعالیت MPO در گروه کنترل درمقایسه با گروه جمعیت عادی به میزان
زیادی افزایش داشت (بافت کولون4.760.15vs . 2.89 0.17 u/g). در حالی که در گروه های تحت درمان با عصاره تام گیاه Lippia citrodoria و پردنیزولون (1.14 mg/kg) در مقایسه با گروه کنترل، میزان فعالیت MPO کاهش نشان داد. میانگین درصد کاهش فعالیت MPO در گروههای تحت درمان با عصاره به لیمو و پردنیزولون به ترتیب 15 و 5 و 26 و 55.1 . 56.1 بود. میزان TBARS در گروه کنترل در مقایسه با گروه جمعیت عادی افزایش داشت (بافت کولون 5.11 0.50vs . 3.14 31 ) در
گروههای تیمار شده با عصاره Lippia citrodoria در غلظت(200-50 mg/kg) و پردنیزولون (1.14 mg/kg) میزان TBARS کاهش نشان داد. میانگین درصد کاهش میزان TBARS در گروههای تحت درمان با عصاره Lippia citrodoria و پردنیزولون 7.9 و 16.35 و 33.9 و 35.6 بود.
بحث
نتایج ارزیابیهای میکروسکوپی و ماکروسکوپی و بیوشیمیایی، نشان داد که عصاره گیاه L.citrodoriaدارای توانایی مهار کولیت در موشهای مورد آزمایش میباشد بطوریکه بکارگیری عصاره گیاه L.citrodoria، فعالیت MPO و غلظت TBARS را
جدول 1. اثر دوزهای مختلف عصاره تام گیاهL. citrodoria روی ویژگیهای ماکروسکوپیک در کولیت القا شده بوسیله استیک اسید در موش
گروه |
میانگین خراشهای ماکروسکوپیک |
کنترل |
4.120.13a |
پردنیزولون |
1.39 |
عصاره گیاه 50 |
3.01 |
عصاره گیاه 100 |
|
عصاره گیاه 200 |
1.31 |
a: کاهش خراشیدگی ماکروسکوپیک در مقایسه با گروه کنترل
b: مقادیر خراشیدگی ماکروسکوپیک از لحاظ آماری برای گروههای تحت درمان با L.citrodoriaو پردنیزولون یکسان بود.
جدول 2- اثر غلظتهای مختلف عصاره تام گیاه L.citrodoria بر ویژگیهای میکروسکوپی در کولیت القا شده توسط اسید استیک در موش
گروه |
میانگین خراشهای میکروسکوپی |
کنترل |
|
پردنیزولون |
|
عصاره به لیمو 50 |
|
عصاره به لیمو 100 |
|
عصاره به لیمو 200 |
a: کاهش بسیار مشخص خراشهای میکروسکوپی در گروه های درمان شده در مقایسه با گروه کنترل است (P<0.01)
b: مقادیر خراش های میکروسکوپی برای گروه های تحت درمان L.Citrodoria و پردنیزولون که از لحاظ آماری تفاوت ندارد.
کاهش داد. MPO و TBARS فاکتورهای مهمی در تنش اکسیداتیو و مارکرهای کولیت میباشند [19، 1،2،5،7،9]. اثرات دوزهای مختلف عصاره به ویژه200 mg/kg عصاره گیاه L.citrodoria بسیار مشابه پردنیزولون بود که این مسئله باعث محافظت گیاه در مقابل کولیت شد. بررسیهای میکروسکوپی و ماکروسکوپی و بیو شیمیایی و هستیولوژیک نشان داد که مدل کولیت القا شده توسط استیک اسید در موش مشابه کولیت اولسراتیو در انسان بود. این بیماری قسمت انتهایی کولون را درگیر و منجر به التهاب در بخشهای سطحی، ادم مخاطی، نکروز پیشرفته در لایههای مخاطی وزیر مخاطی و حتی زخم در ناحیه زیر مخاط میگردد. شکل پروتونه شده اسید پروتونهایی را در فضای بین سلولی آزاد و منجر به اسیدی شدن فضای بین سلولی و آسیب وسیع اپی تلیال میشود. التهاب وجه تمایز مهمی از بیماریزایی IBD میباشد. پاسخ التهابی ایجاد شده توسط استیک اسید، شامل فعال شدن مسیرهای سیکلواکسیژناز میباشد [11،13]. داروی پردنیزولون به عنوان یک داروی ضد التهابی، تعداد ماکروفاژها را در ناحیه مبتلا کاهش و باعث
مهار سنتز تعداد زیادی از واسطههای التهابی نظیر
IL-1 از مونوسیتها، IL-2 و فاکتور نکروزتوموری لنفوسیتها میشود. پردنیزولون سبب مهار آنزیم فسفولیپاز A2 شده و از این راه سبب کاهش میزان پروستاگلندینها و کلوترینها میشود [19]. بنابراین فرض بر این است که L.citrodoria دارای اثرات مهاری بر روی سنتز یا آزادسازی واسطههای التهابی است. در تائید این فرضیه، مشخص شده که این گیاه دارای اثرات تب بر بوده و در درمان سر درد و سرگیجه و دل پیچه و دل درد و سوء هاضمه، دردهای عصبی یک طرفه تهوع، تپش قلب، اسهال درمان بیماری کاندیدیازیس کاربرد دارد[20]. مطالعات نشان دادهاند که اسانس Lippa citrodoria دارای فلاونوئیدها، لینالول، لیمونن، کاریوفیلن اکساید به عنوان سزکوئی ترپن میباشد [16،20]. استخراج عصاره متانولی L.citrodoriaبا استفاده از انواع روش کروماتوگرافی (GC.HPLC , TLC.CC) نشان داد که گروهی از ترکیبات فلاونوتیدی در این گیاه وجود دارد که شامل Salvigen، enpafolin، Hispidolin، luteolin،Cismartin، diosmetin، Cirsilolمیباشد [20]. فلاونوئیدها - به عنوان جز اصلی در عصاره تام L.citrodoria ، دستهای از ترکیبات فنولی گیاهی با ویژگیهای مشخص آنتیاکسیدانی و کلات کنندگی هستند که باعث مهار پراکسیداسیون لیپیدها و کلات فلزات دخیل در اکسیداسیون - احیا و تضعیف فرآیندهای منتهی به تولید ترکیبات فعال اکسیژن شده و از این نظر توجه زیادی به مداخله مواد پلی فنولیک با مخاط رودهای ونقش احتمالی آنها به عنوان تنظیم کنندههای تکثیر و مرگ تنظیم شده سلولی (آپوپتوز) در سلولهای سریع تکثیر شونده اپی تلیوم دستگاه
گوارش میشوند [21،22]. مطالعات اخیر نشان دادهاند که تاثیر فلاونوئیدها بر روی التهاب تجربی کولون مثبت میباشد [26، 25]. خشی از اثرات مثبت فلاونوئیدها به دلیل اثرات ضد دردی آنها بوده ]23،24[ و اثرات ضدالتهاب فلاونوئیدها با کاهش ارتشاح نوتروفیلها، تنظیم منفی IL-1B و کاهش تولید پروستاگلندین در مخاط کولونی مرتبط میباشد [27]. زیرا شواهد نشان میدهد که فلاونوئیدها دارای فعالیت ضد فسفر دی استراز داشته و میزان نوکلئوتیدهای حلقوی داخل سلولی را افزایش میدهند [28].
مطالعات اخیر نشان میدهند که CAMP و CGMP میتوانند تنش اکسیداتیو را در تعداد بیشماری از سیستمهای بیولوژیک و نیز بیماریها مهار نمایند [29،30،34،36]. همچنین فعالیت آنتیاکسیدانی عصاره و اسانس L. citrodoria در تعدادی از تستهای Invitro ارزیابی شده است [31،37]. توانایی حذف رادیکالهای آزاد عصاره این گیاه توسط تست DPPM ارزیابی شده است]37[ و اثرات مثبت L. citrodoria در IBD را می توان به توانایی آنتیاکسیدان این گیاه نسبت داد [31،33،37]. مشخص شده که ترکیبات پلی فنولیک مسئول غیر فعال کردن رادیکالهای آزاد بوده و تنش اکسیداتیو نقش مهمی در پاتوژنز آسیب روده ای مرتبط با IBD دارد [9-7،32-38]. در حقیقت آسیب مخاط روده در IBD، بیماری کرون و کولیت- اولستراتیو هم باعث افزایش تولید رادیکال های آزاد و کاهش غاظت آنتی اکسیدانهای اندوژن میشود [37-6]. زیرا فعالیت MPO که آنزیم اصلی در تشکیل ترکیبات فعال اکسیژن و آسیب باقتی میباشد در مدل کولیت در مطالعه حاضر افزایش داشت. MPO همراه
با NADPH اکسیداز در تشکیل ترکیبات فعال اکسیژن و اکسیداسیون مواد زیستی دخیل میباشند. این آنزیم نه تنها ترکیبات مسئول اکسیداسیون تولید میکند بلکه در تنظیم پاسخ به میکروارگانیسمهای مهاجم نیز دخالت دارد [39-42]. همچنین اسانس و عصاره متانولی این گیاه دارای فعالیت ضد باکتری علیه چند سویه باکتری گرم مثبت و منفی بود که میتوان فعالیت ضد باکتریال اسانس را به وجود تیمول و کارواکرول نسبت داد] 41[. بنابراین فعالیت ضد میکروبی L.citrodoliaمکانیسم مثبت دیگری برای اثرات سودمند این گیاه در IBD بود. مشخص شده که تیمول باعث تخریب دیواره سلولی میگردد [32،41].
جمعبندی
دادههای این مطالعه نشان داد که عصاره گیاه L.citrodia اثرات مثبتی روی مدل تجربی IBD داشت که این اثر را میتوان به فعالیتهای آنتی اکسیدانی، ضد میکروبی و ضد التهاب این گیاه نسبت داد. با توجه به شباهت کولیت القا شده با استیک اسید به کولیت اولسراتیو در انسان میتوان نیجه گرفت که عصاره lippia citrodoriaدر درمان کولیت اولسراتیو در انسان نیز دارای اثر بخشی سودمندی میباشد که مطالعات بالینی بیشتر برای تایید این نتایج باید انجام شود.
تشکر و قدردانی
مسائل اخلاقی این پژوهش زیر نظر دانشگاه علوم پزشکی ایران انجام گرفته، همچنین بحشی از این تحقیق مستحرج از طرح پژوهشی میباشد و از حمایت مالی و معنوی معاونت محترم پژوهشی واحد رودهن کمال تشکر را دارم.